이 작품은 LNN에 룬드 벡 주니어 그룹 리더 원정대에 의해 지원되었다. PWW는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC)의 보조금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 디스크 현미경을 회전에 액세스 남부 덴마크 대학에서 덴마크 분자 바이오 이미징 센터 감사합니다.

KICS 분석 세포막에서 EGFP-태그 된 단백질의 취득은 표면 형광 현미경 TIRF 설정 또는 그 막의 이미지를 얻기위한 설정 회전 디스크 현미경에서 수행 될 수있다. 영상 프레임 간의 카메라 화소 크기뿐만 아니라 시간은 분석을 위해 필요하다. 4-30 Hz의 프레임 속도 100-1,200 프레임 이미지 시퀀스가​​ 분석을 위해 사용될 수있다. 획득 동안, 영상의 재생 시간에 걸쳐 초점 멤브레인을 유지하고 형광이 균일하게 분포되는 평막의 일부분에 집중하는 것이 중요하다. , 소포 이동 막 지역 및 세포 소기관을 돌출하는 것은 나중에 분석 과정에서 잘릴 수 있습니다. 셀의 제공된 드리프트 나 움직임이 없도록 획득 시간이 선택되어야한다. MATLAB에 대한 한국 통신 학회 코드 스크립트를 얻으려면, 폴 현자 문의 (Paul.Wiseman @ McGill.ca). 첫 번째 시간은 한국 통신 학회 코드는 오픈 MAT에게 사용LAB 및 파일을 클릭 한 다음 설정 경로, 다음 하위 폴더 추가를 클릭하고 KICS 코드가있는 컴퓨터의 폴더를 찾을 수 있습니다. 그런 다음 확인을 클릭 저장 부근에 있습니다. 이제 다음의 점에 설명 된 작물의 분석을 계속합니다. 1. TIFF 스택으로 영상 분석 프로그램에 관심있는 이미지 시퀀스 가져 오기 stack1.tif : 이름으로 파일을 저장합니다. <ol><li> 막 움직이는 세포의 세포 기관을 제외하고 막 영역을 돌출의 평평한 부분에 관심 (ROI)의 사각형 영역을 선택합니다. 충분한 통계가 좋은 K 2 플롯에 대해 생성되도록 작물의 크기가 선택됩니다. </li><li> 지역 자르기 및 해당 폴더에 TIFF 파일로 작물을 저장합니다. 같은 영화에서 여러 가지 작물이있는 경우, 예를 들면 &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif를&quot;숫자 증가를 사용합니다. </li><li> 로컬 작물이 들어있는 폴더를 배치컴퓨터가 아닌 서버에서, 한국 통신 학회의 분석을하고있다. </li></ol> 2. 분석을 수행 할 하나 분석 소프트웨어 하나에 작물을 가져 <ol><li> 명령 창을 눌러 열려 MATLAB 및 유형 &quot;icsgui은&quot;을 입력합니다. ICS는 GUI 화상 상관 분광법 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램을위한 실행 파일 이름이다. </li><li> ICS의 GUI에서 &quot;한국 통신 학회&quot;탭을 클릭합니다. 분석 윈도우의 스크린 샷은도 1에 도시된다. </li><li> 폴더 이름 &quot;MATLAB 코드로&quot;폴더를 찾아 파일 이름을 &quot;스크립트&quot;로 파일을 이동하고 그것을 더블 클릭하여 엽니 다. 또한, 파일을 마우스 오른쪽 클릭하고 &quot;MATLAB으로 열기&quot;또는 파일로 이동, MATLAB에서 열고 스크립트 파일을 열기를 선택합니다. 이 파일은 편집기라고합니다. </li><li> 편집기 스크롤 &quot;로드 KICS 데이터 세트&quot;에, 다음 명령 행에 복사 또는 형식 파일 이름과 폴더 위치에서 시작IMG = 예 &quot;: 사용자 문서 AQP3dynamics stack1crop.tif C&quot;와. 예를 들어, [1:500] - 폴더 위치 아래의 명령 행에서 분석 할 프레임 수를 설정합니다. 데이터 계열의 모든 연속 영화에 대해 동일한 설정을 사용합니다. 포커스 드리프트하기의 범위 내에있는 경우, 이들 분석에서 제외한다. </li><li> 편집기에서 &#39;저장&#39;을 클릭 한 다음 &quot;셀을 평가&quot;를 클릭합니다. 데이터 집합은 이제 분석 소프트웨어에에로드됩니다. </li><li> GUI에서 한국 통신 학회 분석 창에서 분석을위한 설정을 입력합니다 : <ol><li> &quot;T 세포&quot;상자를 지 웁니다. </li><li> 입력 시간의 수는 분석 될 떨어진다. 타임 래그 (τ)의 수는 확산 플롯에 영향을 미칠 것이며, 확산 플롯 선형이되도록 선택되어야한다. 25을 입력 시작하고 확산 음모 선형 곳으로 감소. τ는 수이다 KICS 분석를 비교 타임 래그와 시간 차이는 시간 B이며etween 한 프레임과 다음. 선형 플롯을주는 작은 값을 선택해야합니다. 시간의 최대 수는 선형 피팅은 높은 값이 끼워 줄 수없는 데이터를 생성 할 것이다 가리지 얻어 지도록 선택된다 떨어진다. </li><li> 최대 K 2 값을 입력합니다 (그림 1 원 1 참조), 일반적으로 20 ~ 50입니다. 좋은 K 2 플롯 라인을 따라 분포되어 많은 데이터 포인트가되는 플롯이다. (70)를 입력 시작하고 K 2 및 확산 음모를 평가 한 후 감소와 가장 낮은 값을 선택 곳 직선 주위의 데이터 포인트 클러스터. 이 K 값은 푸리에 공간에서 공간적 K-벡터의 크기의 제곱이다. 좋은 K 2 플롯 : 초기 분석은 최고의 가치가 결정 될 때까지, 다음 선택한 설정이 데이터에 잘 맞는을주고 있는지 확인 항상 데이터 계열의 모든 연속 영화에 대해 동일한 설정을 사용하지만 반복해야합니다및 선형 확산 플롯. </li><li> &quot;저장 설정을 계속 진행&quot;을 클릭합니다. </li><li> 모든 그래프를 표시하기 위해 &quot;예&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;로드 이미지 시리즈&quot;(그림 1의 원 2 참조)을 클릭 한 후 &quot;작업 공간&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;imgSerCrop&quot;를 선택한 다음 &quot;작업 영역에서 가져 오기&quot;를 클릭합니다. </li><li> 촬상 시스템 모음 설정을 입력하세요. 박스 &quot;화소 사이즈」화상 스택을 취득하는 촬상 시스템의 투영 화소의 크기를 입력한다. AQP3-EGFP를 들어, 0.111 사용 하였다. 상자 &quot;프레임 사이의 시간 (초)을 입력합니다&quot;에서 0.1150는 AQP3-EGFP를 사용 하였다. </li><li> &quot;1&quot;, 확인을 클릭하고 &quot;전체 이미지를 사용하여&quot;입력 &quot;의 ROI를 선택&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;할 일 한국 통신 학회 분석&quot;을 클릭하고 &quot;움직 필터링&quot;을 수행하는 예를 클릭합니다. 결과는 이미지로 자동으로 열립니다. </li><li> 설정 창을 최소화, 셀 정보 진열창을 최소화w 및 광 물리학 창을 최소화한다. 역학 창에서 역학 플롯은 데이터 포인트의 상관 관계 무료 확산 간주 될 수 있음을 의미하는 음의 기울기를 가진 라인에 데이터의 선형 적합을 표시되는지 확인합니다. 특정 시간 지연에 대한 확산 계수를 기록하고이 설정을 (그것의 적당한 표준 편차에주의 할 필요가 없다) K. K 2 그래프의 데이터 포인트는 떨어진다 주어진 시간 동안 라인 주위에 클러스터해야합니다. </li><li> 진드기 상자 &quot;이미지로 열린 그림 저장&quot;을 한 후 결과 파일을 저장하려면 &quot;이미지로 열린 그림 저장&quot;을 클릭합니다. C 아래에 새 폴더에 저장 : 사용자 문서 AQP3diffusion을 . &quot;분명 현재의 데이터&quot;를 클릭하고 다음 작물의 분석을 계속합니다. </li></ol></li></ol> 계산 된 확산 계수 3. 평균은 분석 데이터의 개요를 계산한다 <ol><li> spre의 각 투자 수익 (ROI)에서 각각의 확산 계수를 입력adsheet (τ를 기록하고 2 값을 K해야합니다), 위의 설정과 작물의 이름을 사용합니다. </li><li> 스프레드 시트 프로그램을 이용하여 확산 계수의 평균 및 표준 편차를 계산한다. </li><li> 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트 또는 학생 5 %의 유의 수준을 사용하여 통계적인 차이를 평가하는 t-검정을 수행합니다. 세포 (예를 들어 nontreated 대 처리) 사이 Quantitave 비교는 할 수있다. </li><li> 각각의 작물에 대해 분석 소프트웨어에 의해 생성하고, 각각의 타임 래그의 각 조건에 대해 데이터를 평균 하였다 확산 플롯의 스프레드 시트의 버전을 연다. 논문이나 프리젠 테이션을 표시하기위한 새로운 평균 확산 음모를 생성합니다. </li></ol>

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	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 논문은 형광 단백질 태그로 단백질의 현미경 화상으로부터 확산 계수를 결정하기 위하여 통신 학회 분석 방법을 적용하는 방법의 상세한 단계별 개요를 제시했다. 분석 라벨링 밀도 매우 광범위한 동적 범위를 가진 프로브 선택 독립적이며, 따라서 또한 양자점뿐만 아니라 염료 등 EGFP 같은 형광 단백질로 표지 단백질에 적용될 수있다. 단백질 유효 확산 계수를 계산하기...

세포막 단백질의 사 차원 시공간 조직 횡 이동성 단단히 규제 및 단백질 기능, 활성 및 단백질 - 단백질 상호 작용의 역할을 할 수있다. 세포막 단백질의 측면 확산은, 전통적으로 양자점의 저속 촬상로부터 단일 입자의 확산 계수를 산출하거나 표시된 세포막 단백질 2-4 염색에 의해 연구되었다. 이 방법은 단백질 폴딩과 기능을 손상시킬 수 있으므로, 일부 단백질을 얻을 수없는 양자점 나 염료 라벨링 세포막 단백질의 세포 외 태그의 삽입을 필요로한다. 양자점의 입체 볼륨은 단백질 5의 확산 속도를 느리게하고, 또한, 인구의 단백질의 단지 작은 부분이 양자 도트로 표시되어 보여왔다,이 분수는 총 대표적인 경우는 알려져 있지 않다 세포막 단백질의 풀. 단일 입자 TRA양자점 표지 단백질의 이미지 시리즈에서 확산 계수의 요리하는 (SPT) 측정 매핑 두 차원 가우스와 함께 입자의 이미지가 피크 위치 광범위한 분석 알고리즘 다음에 적합하다을 포함한다. 분석 기술 입자 궤적에 현미경 점 분포 함수 (전형적 이차원 공간 가우시안) 및 입자 위치의 후속 링크의 근사치에 경과 시퀀스의 각 화상 프레임에 피팅 유용한 비 - 선형 곡선을 필요 계산적 매우 집약적 단일 분자 6,7의 움직임. 최근에 개발 된 이미지 상관 기법은 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)는 찬란 세포막 단백질을 태그 확산 계수의 상대적으로 간단한 측정을 가능하게한다. 일상적 KICS 의해 형광 단백질로 표지 막 단백질의 확산 계수를 계산하는 가능성 보유 고유 도구전통적인 양자에 비해 여러 장점이 SPT 분석 점 : 세포 라벨링 소모 세포 태그와 시간의 삽입은 없음 (형광 단백질을 발현하는 세포주가 사용될 수있다) 요구되지 않는다; 확산 계수는 양자 점으로 표시된 부분 집합에 비해 형광 단백질의 전체 풀에서 추출된다; 분석은 단일 단백질을 추적 할 필요없이 간단하고, 분석은 추가적인 사용자 프로그래밍 대한 요구와 함께 기존의 코드를 사용하여 수행 될 수있다. 는 확산 계수의 고속 연산 및 계산을 가능하게 평균화 기법이므로 방법은 빠르다. 단백질 인구 이러한 급속한 확산 측정 근면 SPT 방법으로 인구의 서브 세트에 대해 얻은 분자량보다 상세한 교통 정보를 보완. KICS 시간 먼저 푸리에 공간으로 변환 된 형광 현미경 이미지 시퀀스의 상관 관계를, 이에 플로리다를 분리분자 수송 1에 의한 것과 광 물리학에 의한 uorescence 변동. 결과적으로, 통신 학회는 수밀도를 결정 속도를 흐르게하고, 복잡한 광표백 의해 공정한 지거나, 형광의 점멸 중에 확산의 형광 분자를 표지 할 수있다. 이것은 통신 학회 신속 정의 기입 알고리즘 없이도 형광 표지 된 세포 막 단백질의 확산 동성을 결정하기위한 유용한 도구를 만든다. 게다가 형광 표지 된 단백질은 KICS 또한 양자점 표지 된 막 단백질 (8)에 적용될 수있다. 이 문서는 코드와 방법에 생성 된 플롯을 평가하는 방법을 사용하는 방법, 작물을 배치하는 방법을 보여줌으로써 EGFP-태그 세포막 단백질의 확산 계수를 추출하기 위해 한국 통신 학회를 사용하는 방법을 단계별로 소개를 제공하는 확산에서 계수가 추출된다. 예로서, 반 내부 전반사에 디스크 현미경 세트를 회전하여 얻어진 데이터는 형광EGFP 태그 신장 물 채널 단백질 아쿠아 포린 -3 (AQP3)의 후부 (TIRF) 모드가 표시됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

측면 확산과 세포막 단백질의 구획화 단단히 세포에서 조절되고, 따라서, 이러한 프로세스를 연구하는 세포막 단백질 기능 및 규제에 새로운 통찰력을 밝힐 것이다. 최근 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS) (1)는 직접 프로브 광 물리학에 의해 도입 된 체계적인 편견을 피할 찬란 태그 세포막 단백질의 이미지에서 확산 계수의 일상적인 측정을 가능하게하기 위해 개발되었다. 분석을위한 이론적 근거는 복잡하지만,이 방법은 단백질의 확산 계수를 측정하기 위해 개방 코드를 사용 비전문가에 의해 구현 될 수있다. 한국 통신 학회는 상호 (K-) 공간에 각 이미지의 푸리에 변환 한 후 형광 현미경 이미지 스택에서 시간 상관 함수를 계산합니다. 이어서, 원형 평균화, 자연 대수는 변환 및 선형 산출 상관 함수에 확산 계수를 적합하다. 이논문은 한국 통신 학회를 통한 이미지 분석 및 확산 계수의 측정에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 먼저, 형광 표지 된 세포막 단백질의 높은 프레임 레이트 콘텐츠의 시퀀스는 형광 현미경을 이용하여 획득된다. 그런 다음, 관심 (ROI) 막 영역을, 세포 내 소기관을 피하고 소포를 이동하거나 돌출의 영역이 선택됩니다. 투자 수익 (ROI) 스택은 자유롭게 사용할 코드로 가져 여러 정의 된 매개 변수 (방법 섹션을 참조하십시오) 한국 통신 학회 분석을 위해 설정됩니다. 프로그램은 K-시공간 상관 함수에서 플롯 &quot;슬로프의 기울기&quot;이 발생하고, 확산 계수는 플롯의 기울기로부터 계산된다. 아래 정식 예로 EGFP 태그로 신장 수로 아쿠아 포린 -3 이용한 세포막 단백질의 확산 계수를 측정하는 단계별 KICS 절차이다.

KICS로 분석하기에 적합한 화상 스택을 획득하기 위해, 다른 현미경 시스템이 사용될 수있다. 그것은 에피 형광 현미경 등 TIRF 또는 스피닝 디스크 설정으로부터 이미지 시퀀스를 분석하는 것이 가능하다. 막 어떤 큰 움직이는 세포 소기관없이 또는 소포 / 움직이는 물체 평면해야합니다. 이 논문은 23.4 ㎐의 프레임 속도 원형질막으로 설정된 초점 회전 디스크 현미경에 결상 라이브 MDCK 세포에서 EG...

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

이 논문은 형광 라이브 포유 동물 세포에서 세포막 단백질을 표지 확산 계수를 측정 변동 분석 기술 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)에 대한 단계를 안내하여 단계를 제공합니다.

K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 조회수.  Aarhus University.  이 논문은 형광 라이브 포유 동물 세포에서 세포막 단백질을 표지 확산 계수를 측정 변동 분석 기술 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)에 대한 단계를 안내하여 단계를 제공합니다. 

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Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

연구

생물학

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

디지털 이미지의 상관 관계를 사용하면 혈관 조직 표본의 로컬 균주의 특성을

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...