저자는 방법론의 발전에 공헌을위한 실험실의 과거와 현재 회원이 조언은 여기와 앨런 Cochrane에 대한 설명 감사합니다. 라는 프레 이저, Monat 및 MacPherson 경력 상가 지원하는 보건 연구 (CIHR) 박사 원정과 AJM의 캐나다 연구소의 수신자입니다. 이 작품은 CIHR (교부금 # 걸레-56974)에서 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 프로브 준비 <ol><li> 시험 관내 전사 벡터에의 다이제스트 1 μg은 1 시간을위한 PKS (+) POL 37 ° C에서 Kpn1 효소와 236nt 9는 아가로 오스 겔에 대한 선형 DNA의 제품을 실행합니다. 조각은 약 2,500 BP 있어야합니다. </li><li> 겔의 조각을 도려하고 로슈 마이크로 Elute 젤 추출 키트 (사용되는 모든 시약은 표 1에 나와있는)을 사용하여 정화. 30 μl 용출 버퍼의 마지막 용출을 수행합니다. 정화를 확인할 수 아가로 오스 겔에 제품을 5 μl를 실행합니다. </li><li> 12 시간 동안 37 ° C에서 로슈 쫄지마 RNA 라벨링 키트와 부화를 사용하여 시험 관내 전사 반응 (아래 제조법 참조)에서를 섞습니다. </li></ol> 시험 관내 전사 반응에서 : <table border="1"><tbody><tr><td> 선형의 DNA </td><td> 23 μl </td></tr><tr><td> 1X 쫄지마 RNA 라벨 믹스 (로슈) </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 1X Transcription 버퍼 </td><td> 8 μl </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA 중합 효소의 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 40 μl </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> 15 분 동안 37 ° C에서 DNase I 및 품어의 228 U를 추가합니다. </li><li> 20 mm의 최종 농도에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0을 추가하여 반응을 중지합니다. </li><li> 제조 업체에서 지정한 로슈에서 빠른 회전 열을 사용하여 반응을 정화. </li><li> 10분의 1 볼륨 DEPC-처리 3M NaOAc의 산도 5.2과 얼음처럼 차가운 95 % 에탄올 2.5 권으로 석출하여 프로브를 정화. 섞어서 하룻밤 ~ 30 분 -80 ° C에서 품어. </li><li> 15,000 X g에서 4에 15 분 ° C에 대한 프로브를 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는를 제거하고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올에 펠렛을 씻는다. 15,000 X g에서 4에 5 분 ° C에 다시 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거한 후 펠렛을 건조. 50 μl w에 펠릿을 Resuspend10 U Invitrogen RNase 아웃 포함된 ater (DNase / RNase 무료). </li><li> 분광 광도법에 의한 프로브의 농도 (260 nm의에서 측정 RNA)를 산정하고, μl / NG 5의 농도로 희석. ° C에서 장기 저장을위한 단기 사용하거나 -80 용 -20 ° C에서 aliquots의 상점. 그것은 너무 이것에 대한 나누어지는을 절약 상호 분석 비교를 수행하는 것이 좋습니다. </li></ol> 2. 세포 고정 <ol><li> 수확시 최종 confluency 약 70~80% 수 있도록 그것은 치료, 살균 유리 coverslips쪽으로 씨앗 자기편 세포가 처음에는 중요합니다. 비 점착 성의 세포의 경우, 정상적으로 성장하고 언제 수집할 준비, 1 시간 동안 0.01 % W / V 폴리-L-라이신 (시그마 - 올드 리치 주식 회사)로 처리되었습니다 coverslips으로 그들을 품어. 전형적인 12도 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 (3.8 cm 2)의 경우 150,000 세포 (예 : HELA) transfection 이전 24시간에 도금하고 있습니다. 비 점착 성의 세포가 감염 또는 transfected 정상적으로 및 광고에 사용할 수 있습니다여기에 고정 세 이전에 유리 커버 풀리지 않고 있습니다. </li><li> 미디어를 취소하고 1 분 동안 두 번 증류수 (DPBS)에 준비 인산 버퍼 1X 식염수 세포를 씻는다. Diethylpyrocarbonate이 (DEPC, 시그마 - 올드 리치 주식 회사) 1X PBS도 사용할 수 있습니다 - 취급 그러나 치료 PBS 그것은 RNase의 효소가 포함될 수 없습니다로서. </li><li> PBS를 버리고 완전히 세포를 충당 하고도 4 % paraformaldehyde를 추가합니다. 15-20 분 동안 품어. </li><li> paraformaldeyhyde을 무시하고 1 분 1X DPBS로 세포를 씻어. </li><li> DPBS을 무시하고 0.1 M 글리신을 (1X DPBS에 녹아있는) 추가합니다. 10 분 동안 품어. </li><li> 글리신을 무시하고 1 분 1X DPBS로 세포를 씻어. </li><li> DPBS을 취소하고 트리톤-X (1X DPBS에 녹아있는) 0.2 %를 추가합니다. 5-10 분 동안 품어. nucleolar 또는 핵 봉투 단백질에 대한 더럽히는 것 있으면 트리톤 더이상 5 달러는 분, 또는 단백질 지방화를위한 X-100은 확산이 될 것입 함께 permeabilize. </li><li> 트리톤 X-100을 취소하고 한번에 씻어1 분 용 1X DPBS. </li><li> 장기 보관의 경우 최대 4 개월 동안 4 ° C에서 70 % 에탄올 및 매장으로 PBS를 교체하십시오. 또는 1X DPBS으로 한 번 더 씻어과 생선을 참조하십시오. </li></ol> 3. 원위치 하이브리드화의 형광 (물고기) <ol><li> coverslips이 에탄올에 저장되어있다면, 1X DPBS로 에탄올을 대체하고 세포가 30 분 동안 rehydrate 수 있습니다. coverslips이 4 ° C.에 저장된 경우 Rehydration는 하룻밤 만에 할 수 있습니다 </li><li> 1 분 용 1X DPBS로 c​​overslips 씻으십시오. </li><li> 청소하고 잘 레이블을 지정하기 위해 간병에 coverslips를 부화 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 18mm coverslip 내용은 슬라이드에 DNase 용액 (시판 25 단위 / coverslip) 50 μl를 추가합니다. 그것 세포 측을 아래로 배치하고, 실온에서 15 분 동안 그것을 품어해야되고, coverslip을 추가합니다. </li><li> 1 분 용 1X DPBS로 c​​overslips 씻으십시오. </li><li> coverslip 당 50 μl 하이브리드화 믹스 (아래 제조법 참조)에 추가42시 슬라이드와 16-18 H 위해 coverslip 셀 측면을 품어 ° C. 배양은 50 % 포름 아미드, 2X SSPE 믹스 (12.5 ML deionized 포름 아미드, 2.5 ML 20X SSPE, 10 ML 물)이 포함된 트레이에 수행되어야한다. </li></ol> 하이브 리다이 제이션 믹스 (한 coverslip, 50 μl의 경우) : <table border="1"><tbody><tr><td> 재고 금액 </td><td> 재료 (최종 농도에서) </td></tr><tr><td> 25 μl </td><td> 포름 아미드, 50 % (deionized; 모든 소스) </td></tr><tr><td> 5 μl (10 밀리그램 / ML 중) </td><td> tRNA, 1 밀리그램 / ML (시그마 - 올드 리치, INC) </td></tr><tr><td> 5 μl (20X의) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 μl (50X의) </td><td> Denharts, 5 배 </td></tr><tr><td> 0.125 μl (5 단위) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 μl (μl / 5 NG 25 NG) </td><td> 탐침 </td></tr><tr><td> 5 μl </td><td> 최종 만드는 H 2 O DEPC,부피 50 μl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> 42시 15 분 50 μl 50 % 포름 아미드 (1X DPBS에 희석)에 품어 coverslips 전지 측면 다운 ° C. </li><li> 42시 5 분마다 50 μl 2X SSPE (20X SSPE는 1X DPBS에 희석)에 그들에게 셀 측면을 잠복기 ° C를하여 2X SSPE에 두 coverslips 씻으십시오 </li><li> 1 분 용 1X DPBS에 coverslips 씻으십시오. </li></ol> 4. Immunofluorescence 염색법 <ol><li> 30 분 50 μl 1X 로슈 차단 솔루션 (1X DPBS에 희석 10X 로슈 차단 솔루션)에 그들에게 셀 측을 아래로 배치하여 coverslips를 차단하십시오. </li><li> 37에서 1 시간 동안 50 μl 일차 항체 용액에 coverslips 셀 측면을 품어 ° C. 안티 - 쫄지마 항체는 1X 차단 솔루션 제조 업체의 지시에 따라 희석되어야한다. 다른 항체가 단백질을 얼룩하는 데 사용되고있다면, 그들이 사용되는 모든 항체는 다른 호스트 사양에서 파생된 것을 제공하는 정확한 농도에 추가할 수 있습니다이거야. </li><li> 1X DPBS에서 10 분 동안 coverslips 씻으십시오. </li><li> 37에서 1 시간 동안 50 μl 이차 항체 용액에 coverslips 셀 측면을 품어 ° C. 알렉사 형석 - 복합 항체 (Invitrogen)은 색상의 범위를 생성하는데 사용될 수 있으며 1X 차단 솔루션, 1X DPBS에서 1:500에서 사용됩니다. </li><li> 10 분 1X DPBS 각각에 대해 두 번 coverslips 씻으십시오. </li><li> 워트 먼지 용지에 coverslips 셀 측면을 건조합니다. 빛과 표백에 대한 노출을 피하기 위해 coverslips를 충당해야합니다. </li><li> 모든 액체가 증발되면, 8 μl ImmunoMount (써모 과학 주식 회사)를 사용하여 새 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. 부드럽게하는 기포를 제거하기 위해 coverslip을 누릅니다. </li><li> 위치에 그것을 확보하기 coverslip의 가장자리 매니큐어가 손톱도 적용합니다. </li><li> 현미경 기술에 의해 RNA와 단백질의 시각화는 또한이 기술의 성공에 중요합니다. 그것이 중요하므로 사용하는 현미경에 대한 설정 시각화 도움이나 방해 수현미경에 대한 설정이 올바르게 설정 한 예제에서 주어진 실험에서 다른 위치로 일치한다. 자세한 현미경 설정의 경우, 광학 및 항체 조합 레퍼런스에게 1,10 참조하십시오. </li></ol> 5. 대표 결과 바이러스성 RNA의 염색법의 예제는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 작은 세포질 punctae이 드문 아니지만 HIV-1 바이러스 RNA는 대부분 diffusely 표시 세포질에 걸쳐 볼 수있다. 특이성은 더 형광을 표시하지 주변 세포에 긍정적인 세포를 비교하여 볼 수 있습니다. 이것은 핵에 밝은 신호와 같은 시각 될 수 있으며, 세포질의 RNA 형광 신호의 부족 :로서 도입에 언급, 규제 레브 단백질이 부족 HIV-1은 핵에 유지됩니다 RNA를 생성합니다. 세포 단백질의 Overexpression는 또한 HIV-1 바이러스 RNA의 분포를 변화시킬 것입니다. 그림 2에 </강한&gt;, endosomal 소포 밀매에 관여 단백질의 overexpression (예 : Rab7 - 상호 작용하는 lysosomal 단백질 (RILP) 11 또는 N-말기 삭제 RILP (RILPN) 11 및 dynein 모터 기능 [예 p50/dynamitin 1을 방해하는 단백질, 12], 생선 분석에 의해 결정으로 바이러스 게놈의 RNA의 정상 정상 상태 지방화에 방해가 RILP 표현식은 미세 소관 기관 센터 (MTOC) 13 바이러스 게놈의 RNA의 다시 지방화에 이르게;. RILPN 늦게 분광 내에서 endosomes dynein 모터 복잡한 14 p50/dynamitin 블록 dynein 모터와 릴리즈의 큰 subunit의 접착 p150에 바인딩하는 무능력으로 인해 세포질 늦게 endosomes뿐만 아니라 세포 주변에 바이러스 게놈 RNA와 HIV-1 구조 단백질 1 (그림 2). 바이러스 게놈의 RNA의 정상 상태 지방화의 조작의 infectiousness에 핵심 기여자바이러스 입자는 치료제의 최종 개발에 열쇠가 될 것입니다. 우리 손에서 바이러스성 RNA는 초기 3시간 포스트 transfection과 감염 10 세포에 나타나고 12시간하여이 물고기 기법에 의해 쉽게 관찰할된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> 1 그림. 물고기 / 공동 분석합니다. 전지를위한 프로토콜의 흐름 차트는 coverslips에 성장 후 paraformaldehyde로 고정됩니다. 세포가 어느 물고기 / IF 사용 또는 스토리지에 70 % 에탄올에 저장되기 전에 글리신 그리고 Triton-X의 처리가 수행됩니다. 저장 건조 세포 물고기 / IF에 계속하기 전에 1X DPBS (DEPC-처리 PBS)에 rehydrated됩니다. 세포 DNase I으로 처리하고 프로브와 잡종을 위해 밤새 남아 있습니다. 일단 하이브리드화가 완료되면 전지뿐만 SSPE와 마찬가지로, 포름 아미드로 씻어, 그리고 최종 1X DPBS는 린스 있습니다. 차단 솔루션과 인큐베이션이어서, 세포에 적용됩니다일차 항체. 세척 후 이차 항체가 적용됩니다. 1X DPBS의 두 최종 세차장은 이미징을위한 coverslips에 따라 건조하고 슬라이드에 장착된 염색법 절차를 완료합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> 그림 2. 대표 결과 생선 / 공동 분석 IF를 사용합니다.) HIV-1은 세포 단백질의 overexpression (RILP, p50/Dynamitin 및 RILPΔN (아미노 터미널 삭제 돌연변이)를 발생 구조와 HELA 세포로하며 어떤 경우 transfected 있습니다) . 물고기 / 공동 분석 IF이 수행되었습니다 : RNA는 차별 G3BP 또는 LAMP1 (빨간색) 중 하나와 함께 녹색으로 식별됩니다. B) HIV-1은 HELA로 표현하고 다른 시간 지점에 수집됩니다. 세포 단백질, hnRNP A1는, 빨간색으로 물들어있는 동안 바이러스성 RNA 발현은 녹색으로 추적됩니다. 크기 막대는 10 μm의 수 있습니다. 참고 문헌 1 (; RILP, p50/Dynamitin 및 RILP deltaN 패널에서 선택한 그림)에서 수정된 이미지17 (패널 B).

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

물고기 / 공동 분석 IF 지금 9,15,16를 수정되어 세포에 바이러스 RNA를 시각화하는 안정적인 방법입니다. 수년에 걸쳐, 우리는 RNA에 대한 더럽히는 것의 세련된 방법을 개발했습니다. 이 기술은 프로브가 대상 RNA 17에만 제공되는 세포 유형의 다양한 배열에 사용할 수 있습니다. 쫄지마로 프로브를 레이블링함으로써 우리는 단순 염색법에 의해 RNA를 시각화 할 수 있습니다. RNA와 다른 단백질에 대한 더럽히는 것이 결합되면, 생선 / IF 공동 분석은 세포 구조와 단백질 / RNA 지방화를 관찰하는 강력한 도구가됩니다. RNA 검출의 특이성은 아주 높습니다. 이것은 그림 2에 설명된됩니다. 레브의 부족이 핵 18에서 바이러스 RNA를 갇힌 것을 설립 바이러스성 게놈 RNA의 현지화, 생선에 초점을 맞춘 독창적인 작품의 일부입니다. 이 때문에, 바이러스성 게놈 RNA의 지방화에 대한 풍부한 새로운 정보 techniqu를 사용하여 얻은되었습니다전자 여기서 설명했다. overexpressing 세포 단백질함으로써, 특정 집단 - 아닌 바이러스성 RNA 모두의는 세포의 여러 지역에 집중하기 위해 강제로 할 수 있습니다. hnRNP A2가에서 siRNA에 의해 소진되면 표현형 유사한 RILP의 overexpression은 얻은 HIV-1-표현, 세포에게 열세 것은 RNA가 가시 MTOC에 축적됩니다. (세포 주변에 세포내 도메인에서 바이러스 게놈 RNA의 릴리스 dynein 중쇄 1 결과 중 p50/Dynamitin overexpression 또는 최저 : 바이러스성 게놈의 RNA는 마이너스 엔드 모터 단백질, dynein을 해제하여 셀 주변에 직면 수 그림 2). 그들은 더 이상 적극적으로 juxtanuclear 도메인에서 현지되기 때문에 더 이상 dynein 모터를 바인딩하지 RILP, RILPΔN의 돌연변이, 분광는 세포질에 (LAMP1로 태그가) endosomes. 이러한 결과는 HIV-1의 게놈 RNA의 특히 플라스틱 인구의 개념을 가리키는 HIV-1 게놈의 여러 수영장바이러스성 복제주기의 때때로 식별 역할과 존재를 알 엔. 이 같은 개념은 이미이 mRNA, 개그 19으로 인코딩된 단백질에 대한 확인되었습니다. 물고기 / 항체의 선택과 예약에 관련된 공동 분석 IF의 용도에 한계가 있습니다. 기본 및 보조 항체, 그들의 농도, 최고의 조합 최적화 (표 1 &amp; 2 참조) 최적화하기 위해 시간이 소요됩니다. 주요 기업 hybridomas 만든이나 생산된 항체가 1시 2분에서 1:2000으로 어디서나 다양하지만, 최상의 결과를 위해 제조 업체에서 제공한 지침에 따라 반드시 농도를 가질 수 있습니다. 항체가 생산되는 호스트도 고려 하에서 촬영되어야합니다. 염소 항체와 혼합 양 또한 교차 종 인식 (데이터가 표시되지 않음)에 의한 높은 배경이 조합 결과로 기본 및 보조 항체에 피해야한다. 알렉사 - 형석 seconda위한공예의 항체는 농도가 집합의 거의 모든 항체에 대해 1:500에서 사용할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된대로 물고기 / 공동 분석한다면 다른 단점은 세포를 고정하고 paraformaldehyde와 세제 (그림 1)를 사용 permeabilized 후에 그것, 정상 상태에서 해당 위치에서 RNA를 캡처합니다. 그러나, 살아있는 세포에서 RNA 이미징은 주로 같은 GFP와 같은 형광 단백질에 의해 태그 바이러스성 RNA의 genomes의 변형을 사용하여 수단 20-22의 다양한 통해 달성되었습니다. 그러나 살아있는 세포에서 RNA의 지방화를 식별하기위한 추가적인 수단이 표면으로 진행합니다. 이 새로운 방법은 시금치 23, SNAP 24 수단, 또는 MTRIP 2로 태그 RNA를 포함. 이러한 기법은 또한 잔기가 현미경에 의해 mRNA를 검출 위해 mRNA에 태그를 추가할 수 있도록 설계되어야 기판을 추가하거나 이전에 세포를 permeabilize하는 요건을 포함하여 몇 가지 단점으로 고생. 실제로 주요 adva이 보고서에 제시된 생선 분석의 ntage는 원시 RNA가 가장 생리학 관련성이 높은 결과로 이어지는 변형이라는 사실에있다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 18mm coverslips </td><td> VWR </td><td> 48,380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16 % paraformaldehyde </td><td> JT 베이커 </td><td> S898-07 </td><td> 4 % 만들려면 : 5 드랍스 NaOH와 60 ° C에서 500mL 1XDPBS에서 20g를 해산. -20 ° C.에 열과 매장 오프 7.2 산도 70을 초과하지 마십시오 ° C ~! </td></tr><tr><td> 트리톤-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 Elute 젤 추출 키트 </td><td> 로슈 </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> 쫄지마 RNA Labelling 믹스 </td><td> 로슈 </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> 전사 T7 RNA 중합 효소의 </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> 빠른 스핀 열 </td><td> 로슈 </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X의 DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 항체 향상제는 쫄지마 감지를 위해 # 4 (차단 솔루션)를 설정 </td><td> 로슈 </td><td> 1,768,506 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석 이차 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> 표 2를 참조 </td><td></td></tr><tr><td> 하이브리드화 오븐 </td><td> Boekel 문화entific </td><td> 모델 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9,990,402 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비의 식별 <table border="1"><tbody><tr><td> 안티 - 쫄지마 항체의 종 (희석, 회사 카탈로그 번호) </td><td> 색상 </td><td> 알렉사 형석로는 (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> 마우스 (1:500, 시그마, B7405) </td><td> 녹색 </td><td> 알렉사 형석 488 당나귀 안티 - 마우스 (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> 빨강 </td><td> 알렉사 형석 594 당나귀 안티 - 마우스 (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> 푸른 </td><td> 알렉사 형석 647 당나귀 안티 - 마우스 (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> 양 (1:200, 로슈, 11376623) </td><td> 녹색 </td><td> 알렉사 형석 488 당나귀 안티 양 (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> 빨강 </td><td> 알렉사 형석 594 당나귀 안티 양 (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> 푸른 </td><td> 알렉사 형석 647 당나귀 안티 양 (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> 표 2. 이차 항체의 조합 및 안티 - 잘봐는 카탈로그 번호와 농도로 표시됩니다.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

세포가 바이러스 복제에 에너지와 자원을 유용하기 위해 사용될 정상적인 세포 기능에 구체적인 변화를 이끌어내는 감염 바이러스. 숙주 세포 기능의 여러 측면은 일반적으로 바이러스성 유전자 제품의 표현으로, 바이러스에 의해 징발되어 채용 숙주 세포 단백질과 기계니다. 또한, 모바일 vesicles 및 모터 단백질에 대한 바이러스 엔지니어 구체적인 멤브레인 organelles 또는 태그가 셀 (드 노보 감염시 바이러스가 공동 제외 분자 모터 단백질 핵을 타겟의 지역을 타겟팅하는 데, 나중에, 바이러스 조립하는 동안, 그들은 세포 공중 납치됩니다 ) 바이러스의 조립에 도움이 될 것입니다 기계. 이하는 바이러스가 특히 RNA의 genomes있는 사람은 단백질과 RNA 구성 요소 모두의 세포내 밀매를 조정하고 그들이 세포의 특정 loci에서 전염성 입자의 조립을 달성하는 방법 방법에 대한 이해된다. RNA의 지방화의 연구는 이전 일을 시작했다. 낮은 진핵세포의 그들을 개발bryos와의 연결 세포가 중요한 생물 학적 정보를 제공하고, 또한 유전자 표현 폭포의 프로그래밍에서 RNA의 지방화의 중요성을 강조. 다른 생물과 세포 시스템의 연구는 유사한 중요한 정보를 굴복했다. 바이러스는 고맙게 여기게 기생충하고 복제하기 위해 호스트 세포를 활용해야합니다. 따라서 그것은 RNA 바이러스가 자손 바이러스 입자 하나에 세포질을 통해 대한 최종 목적지 중 하나와 핵 기공을 통해 핵,,,에서 자신의 RNA의 genomes 직접 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 물고기는 바이러스 RNA의 정상 상태 지방화의 변화를 식별할 수있는 유용한 도구 역할을한다. 공동 분석은 바이러스성 RNA 3 단백질의 공동 지방화에 대한 정보를 제공할 경우 immunofluorescence (IF) 분석 22 물고기 / 결합합니다. 이 분석은 따라서 다른 생화 학적 또는 biophysical에 의해 RNA-단백질 상호 작용에 대해 테스트하는 좋은 시작 지점을 제공합니다자체적으로 공동 지방화 이후로 4,5 테스트, 상호 작용의 일부가 될 수있는 충분한 증거가되지 않습니다. 이와 같은 방법을 사용하여 바이러스 RNA의 지방화를 연구에서는 풍부한 정보는 바이러스와 세포의 RNA 밀매 이벤트 6 모두에서 얻고있다. 예를 들어, HIV-1 감염 세포의 핵에서 RNA를 생산하지만, RNA는 세포질로 번역된다. 키가 바이러스성 단백질이 없거나 (레브) 7, 바이러스 RNA의 물고기는 바이러스 복제에 블록이 핵 8 HIV-1 게놈 RNA의 기억력 덕분임을 밝혔다. 여기서는 원래의 장소에 바이러스 게놈 RNA의 시각적 분석 방법을 제시. 방법은 라벨이 RNA 프로브 이용한다. 이 프로브는 바이러스 게놈의 RNA에 대한 보완이 될 수 있도록 설계되었습니다. 동안 안티 센스 RNA 프로브, digoxigenin (잘해봐)로 수정됩니다 ribonucleotide의 체외 합성의가 체외 transcr에 포함되어 있습니다iption 반응. 탐사선이 세포의 표적 mRNA에 hybridized되면 ​​물고기 / IF를 수행할 때, 후속 항체 라벨 단계 (그림 1)은 mRNA의 국산화뿐만 아니라 관심있는 단백질을 보여줄 것입니다.

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기) 메소드는 시각적으로 형광 현미경을 사용하여 바이러스 게놈 RNA를 탐지하기 위해 개발되었습니다. 프로브가 다음 하이브 리다이 제이션 및 immunofluorescence 기법의 조합을 사용하여 확인할 수있는 바이러스 RNA의 특이성으로 이루어집니다. 이 기술은 세포 내 바이러스 인신 매매 사건의 컨트롤에 정보를 제공, 정상 상태에서 바이러스 RNA 또는 DNA의 지방화를 식별하는 장점을 제공합니다.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.4K 조회수.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. 형광 현장에서 하이브리드화 (물고기) 메소드는 시각적으로 형광 현미경을 사용하여 바이러스 게놈 RNA를 탐지하기 위해 개발되었습니다. 프로브가 다음 하이브 리다이 제이션 및 immunofluorescence 기법의 조합을 사용하여 확인할 수있는 바이러스 RNA의 특이성으로 이루어집니다. 이 기술은 세포 내 바이러스 인신 매매 사건의 컨트롤에 정보를 제공, 정...

비디오: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

연구

생물학

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

빠른 형광<em&gt; 현장에서</emX 염색체 불 활성화에 히스톤 수정의 면역 형광와 XIST RNA 결합에 대한&gt; 하이브리드 프로토콜

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; RNA 풀다운

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...