우리는 DRS 감사합니다. 35S에 대한 스티브 마운트 및 Xiaoning 장 : GFP pGlowbug 구조 Z. L&#39;의 실험실에서 CH 연구에 Hokensen 박사 원정대는 미국 국립 과학 재단 (IOB0616096 및 MCB0744752)에 의해 지원됩니다. ZL는 부분적으로 메릴랜드 농업 실험 역 대학에 의해 지원됩니다.

I. 플라스미드 준비 폭격에 사용되는 플라스미드 DNA는 고순도 및 500ng/μl 이상의 농도에 있어야합니다. BiFC 두 플라스미드 구조를 포함한 각 플라스미드 25 μg이 필요합니다. 즉, 두 plasmids의 1시 1분 어금니 비율은 카트리지의 준비 50 μg 총 플라스미드 DNA을 일으키다로 혼합한다. 50 μg 이상의 DNA를 추가하면 황금 입자의 응집을 일으킬 수 있으며 피해야한다고 염두 수 있습니다. 상용 플라스미드 DNA 추출 키트 플라스미드 DNAs를 분리 권장됩니다. 플라스미드 벡터는 pUC19와 같은 크기가 비교적 작은되어야합니다. 우리는 겁쟁이와 LUH 각각 3 pUC19 - SPYNE와 pUC19 - SPYCE로 cDNA를 복제. Agrobacterium - 중재 변환에 대한 바이너리 벡터가 너무 큽니다과 폭격에 대한 부적 절한 있습니다. II. 카트리지 준비 카트리지 준비는 플라스미드 DNA와 이후 유전자 총 카트리지 홀더에 로드할 수 있습니다 이분의 일 인치 긴 조각으로 절단 플라스틱 튜브로 그들을 로딩과 코팅 골드 입자를 포함한다. 카트리지 준비는 별도의 조브 기사 4 훌륭한 세부 사항에서 설명하기 때문에 여기서 설명하지 않습니다. 양파 세포의 충격을 위해, 우리는 1 μg DNA/0.25 MG 골드 / 카트리지 50 카트리지에 대해 최대 산출 준비 당 금 입자의 12.5 MG와 플라스미드 DNA 50 μg을 혼합하는 것이 좋습니다. 각 카트리지는 한 번에입니다. 금 입자는 0.6 μm의 또는 직경 1.0 μm의 (; Biorad 고양이 # 1652262 또는 고양이 # 1652263) 중 하나가 될 수 있습니다. 우리는 또한 카트리지 준비 0.5 MG / ML PVP 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. BiFC 들어, 동일한 카트리지 준비의 각 putative 상호 작용하는 파트너의 두 플라스미드 DNAs를 결합. 카트리지 준비 후 페트리 접시 감싸있는 사각형 Parafilm에 150-200 PSI 사이의 헬륨 압력에서 새로 만들어진 카트리지를 발사하여 카트리지를 테스트하는 것이 중요합니다. 황금 입자가 카트리지에서 효율적으로 추진 될 수있다면 이것은 테스트 않으므로 Parafilm에 희미한 금 입자를 볼 수 있습니다. 이것은 각 방 표지 것이라는 지역의 아이디어를 제공합니다. 당신은 다른 헬륨 압력 (PSI 150-200 범위에서)에서 Parafilm에 추진 황금 입자의 서로 다른 양의있을 수 있습니다. 더 큰 차이가 없다면, 폭격에 대한 낮은 압력을 선택합니다. III. 준비 양파 조직 촬영 당일, 대형 노란 양파의 표피에서 껍질. 깨끗하고 날카로운 면도날을 사용하여 깊이 약 2 X 8cm의 사각형 영역을 4-5 레이어를 잘라. , 직사각형 양파 조직을 꺼내서 바깥 두 레이어를 삭제, 2X1.5 약 cm의 조각으로 양파의 나머지 레이어를 잘라. 여과지 (왓먼 3MM 종이가 빙빙로 상처)이있는 페트리 접시에 양파 조각을 장소 멸균 물 moistened. 페트리 접시를 커버하고 그들은 갈 준비가 된 것입니다. IV. 충격 <ol><li> 흰색 라운드 카트리지 홀더에 카트리지를로드합니다. 다른 플라스미드 구조를 포함하는 카트리지는 다른 카트리지 홀더에로드해야합니다. 각 카트리지 홀더 12 장면 12 카트리지까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 헬리 우스 진 건에 배터리와 신선한 배럴 라이너를 삽입합니다. 총신 라이너와 총을 모두 붙어 O - 링 각을 가지고 있는지 확인합니다. </li><li> 첫째, 총 상단 직면하고있는 카트리지 홀더에 마르크 # 12, 유전자 총에 빈 카트리지 홀더를 삽입합니다. 사전 카트리지 홀더가 한 두번이 올바르게 삽입되었는지 확인합니다. </li><li> 헬륨 탱크에 총을를 첨부 150-200 PSI 사이의 압력을 조정합니다. </li><li> 총 상공 회의소를 청소하고 압력이 안정되어 있는지 확인하기 위해 빈 카트리지 홀더와 귀 보호 및 화재 총 몇 번 착용하십시오. </li><li> 빈 카트리지 홀더를 제거하고 로드된 카트리지 홀더를 삽입합니다. 해고하고자하는 카트리지는 카트리지 홀더의 (시, 6) 하단에 위치되도록 카트리지 홀더 사전. 여기에 양파 조각을 촬영하면 배경 형광에 대한 부정적인 통제의 형태를 제공합니다. </li><li> 최대 직면하고있는 양파의 내부 대부분의 레이어와 빈 페트리 접시의 중앙에 양파 조각을 놓으십시오. 페트리 접시에서 유전자 총을의 배럴의 라이너를 휴식과 방아쇠 당기는 동안 사이드 버튼을 누른하여 총을 발사. 촉촉한 3MM 여과지를 포함하는 페트리 접시에 포격 양파를 전송합니다. </li><li> 다음 카트리지에 미리와 다른 양파 조각을 해고. 양파의 4-5 조각이 총에 때까지이 단계를 반복합니다. 각 양파 조각이 총을 한 방입니다. </li><li> 다른 플라스미드 또는 다른 플라스미드 조합을 포함하는 카트리지와 함께 로드된 다른 카트리지 홀더로 변경합니다. 배럴 라이너를 변경하는 것을 잊지S는 잘 오염을 방지하기 위해. 4-5 양파 조각을 쏴. </li><li> 충격 후, perti 요리에 대한 모든 양파를 반환합니다. 뚜껑있는 페트리 접시를 커버. 건조 방지하기 Parafilm으로 그들을 바꿈. 16~48시간 동안 짙은 어둠 속에서 실온에서 양파 조각을 품어. </li><li> 헬륨 탱크에서 유전자 총을 분리하기 전에 가스 릴리스 압력을 해제합니다. 돌려서 배럴 라이너, 그리고 카트리지 홀더 및 (또는 미사용) 사용 카트리지를 제거합니다. </li><li> 비눗물로 비커에서 그들을 잠수함이 잠수하여 카트리지 홀더 및 배럴 라이너 청소. 목욕 sonicator에 비커를 놓고 20 분 동안 sonicate. 그 후, 모든 비누 잔류물을 제거하기 위해 물로 그들을 씻어. 시간 동안 70 % 에탄올에서 그들을 만끽하고 종이 타올에 올려 건조. </li></ol> V. 관측 <ol><li> 상온에서 16-20시간에 대한 폭격 양파 조각을 잠복기 후에, 우리는이 연구에 사용되는 등 자이스 혈구 Axio Observer.z1로 형광 현미경을 사용하여 GFP 또는 YFP 형광을 관찰할 수 있습니다. </li><li> 천천히하는 양파의 내부 표피 (직접 폭격하는 동안 총을 얼굴 레이어)에서 단세포 층 평면 껍질 끝을와 집게를 사용하십시오. 슬라이드에 물 한 방울로 껍질을 놓으십시오. coverslip을 추가하지만 거품을 최소화하기 위해주의하십시오. </li><li> 현미경의 밝은 분야에서 먼저 세포가 살아 있도록 세포질 스트리밍을위한 확인하십시오. 이렇게하려면, 이동 plastids 찾는 다음 양파 조직을 따뜻하게하는 데 몇 분 동안 명시야 조명에 슬라이드를 노출합니다. 세포질 스트리밍보고 항상 쉽지 않다, 그래서 당신은 아무것도 볼 수 없다면 낙담하지 마세요. </li><li> 형광 검출을위한 적절한 여기와 GFP 또는 YFP에 대한 검색 필터를 사용합니다. 이러한 아닌 형광 플라스미드로 촬영 양파 조각과 같은 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 희미한 노란색 신호 부상 전지, 공기 방울, 또는 파편으로부터 나타날 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤을 포함하는 것도 중요합니다. 같은 35S 같은 플라스미드가 포함된 constitutively 표현 형광 기자 : GFP는 훌륭한 긍정적인 컨트롤입니다. 양파 표피 세포 (그림 1A, D)에서 볼 수 GFP 신호는 카트리지, 양파 조직 및 유전자 총기 발사가 제대로 준비하고 실행하는 지적했다. : 겁쟁이 - pSPYNE 및 35S : : : LUH - pSPYCE의 DNAs 이후, 우리는 35S의 혼합물을 포함하는 카트리지 공세 양파 조각에 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE 사이의 상호 작용을 관찰했다. 희미한 YFP의 형광이 핵에 함께 분할 YFP의 조각을 가져 겁쟁이와 LUH 사이의 직접적인 물리적 상호 작용을 나타냅니다 (그림 1 B, E) 만 핵에서 관찰되었다. : GFP : BiFC에서 YFP 신호가 35S에서 GFP 신호보다 훨씬 약한입니다. </li></ol> 대표 결과 우리의 연구에서, 여기 35S보고 : 플라스미드 GFP 긍정적인 컨트롤에서 핵 및 세포질 (그림 1A, D)을 모두 포함한 전체 세포를 채우고 강한 형광을 제공합니다. GFP 단백질은 핵 지방화 신호없이 핵에 확산 정도로 작습니다. 대조적으로, 겁쟁이와 LUH 이전 두 하이브리드 분석 2 누룩에 상호 작용하는 그림이 Arabidopsis transcriptional 요인입니다. 겁쟁이 - pSPYNE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합)와 LUH - pSPYCE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합), 핵에 확산 핵 지방화 신호에게 2,5를 포함 모두 너무 큽니다. 양파 세포 핵 (그림 1 B, E)에서 검색된 YFP 형광 신호는 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE은 양파의 핵으로 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다. 아무 형광 신호가 YFP 및 LUH - pSPYCE (그림 1C, F)의 N - 터미널 조각을 포함하는 플라스미드 벡터 pSPYNE의 플라스미드 혼합 공세 양파를 감지하지 않습니다. BiFC - 중재 YFP의 형광은 35S에서 GFP - 중재 형광보다 훨씬 약한입니다 : : GFP 플라스미드. 우리의 연구에서, 그들은 또한 (B와 그림 1A 비교) 다양한 subcellular 지방화을 보여주었다. 두 파트너 pl​​asmids이 성공적으로 입력하고 같은 양파 세포에서 표현하는 경우 BiFC에만 작동하기 때문에 또한, 형광 세포의 숫자는 BiFC에 대해 상당히 낮습니다. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 형광등 (A, B, C)과 명시야 (D, E, F) 양파 세포의 이미지는 다른 플라스미드 구조 공세. (A)와 (D), 양파 세포는 35S 공세 : : GFP. GFP는 세포질과 핵 밖으로 diffuses. (B)와 (E), 양파 세포는 35S 동등한 어금니 믹스 공세 : 겁쟁이 - pSPYNE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합)와 35S : LUH - pSPYCE (LUH는 C - 말단 조각을 융합 ) 플라스미드 DNA. 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE 간의 상호 작용은 형광등 핵으로 표시됩니다. (C)와 (F), 양파 세포를 보여주는 부정적인 제어 벡터 pUC19 - SPYNE 및 LUH - pSPYCE plasmi의 믹스 공세DS. 아무 형광 신호가 감지되지 않습니다.

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li><li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development.">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li><li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development.">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li><li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development.">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

<ol><li> : GFP 또는 35S : : : 거스 처음 사용자를 위해, 우리는 35S와 같은 하나의 플라스미드 제정 기자와 카트리지 준비에서 관찰하는 전체 절차를 연습하는 것이 좋습니다. 우리는 35S 사용 : 플라스미드 GFP는 DRS 얻은. 스티브 마운트 및 Xiaoning 장 6 (그림 1A, D). RioRad (CAT 165-2244)에서 판매하고 유전자 촬영 제어 카트리지 공장에 적합하지 않습니다. </li><li> BiFC 들어, 두 번째 긍정적인 제어가 각각 YFP의 C - 터미널과...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yellow onion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any supermarket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss, Nikon, Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation (bifc) assay for protein-protein interaction in onion cells using the helios gene gun

다양한 생물의 유전자 기능을 조사 유전자 제품들이 정상 세포 환경에서 서로 상호 작용하는 방법에 대한 지식에 의존하고 있습니다. Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이<sup&gt; 1</sup&gt; 연구자들이 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화 수 있도록하고 필수적인 연구 도구가되었습니다. 이 분석은 각 잠재적인 상호 작용하는 단백질 파트너 융합하는 형광 단백질 (GFP)의 두 조각의 촉진 협회를 기반으로합니다. 두 단백질 파트너의 상호 작용 형광로 이어지는, N - 터미널과 GFP의 C - 말단 조각의 연결을 용이하게합니다. 식물 연구원, 양파 표피 세포 때문에 양파 조직을 얻는 방법과 준비의 용이성과 최소한의 배경 형광과 형광의 직접적인 시각화의 BiFC 분석을 실시를위한 이상적인 실험 시스템입니다. 헬리 우스 진 건 (BioRad)은 일반적으로 양파 세포에 플라스미드 DNA를 bombarding에 사용됩니다. 우리의 사용 두 개의 상호 작용에 대한 플라스미드 구조를 소개 진 건 헬리 우스 입증<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; 전사 요소 수스 (겁쟁이)와 LEUNIG의 상동체 (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt;와 양파 표피 세포에 의해 매개 BiFC들의 상호 작용의 시각화.

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Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을 보여줍니다

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

19.5K 조회수.  University of Maryland. 이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을 보여줍니다

비디오: Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Hippocampal 뉴런의 유전자 총을 Transfection

연구

생물학

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 Biolistic Transfection의 준비

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolecular 형광 Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...