1. 효모 준비 <ol><li> GAL1-GFP-Y68L (UBC9 TS) 카세트를 들고 플라스미드와 효모 종자를 변환 할 수 있습니다. </li><li> 16 시간 또는 O / N. 24 시간에 2 % raffinose를 포함하는 합성 미디어에서 효모의 성장과 뒷면 2퍼센트 갈락토오스가 포함 된 미디어에 희석 200 rpm으로 흔들어 동안 30 ° C에서 세포를 배양. </li><li> 다음날 아침, OD 600 = 0.2 쿼리 부담을 희석. 문화 = 0.8-1.0 OD 600에 도달 할 때까지 30 ° C (200 RPM)에서 4-6 시간에 흔들어. </li><li> 식 (그래서 GFP-Ubc9 TS 만 이미 번역 접 풀을 모니터링하는 것과 같이), 2 %의 포도당 (SD) 이전 이미지 30 분을 보충 합성 미디어로 변경 미디어를 주체할 수 있습니다. </li><li> 치료 - 열 충격 37 번 20 분의 세포 ° C misfolding를 유도하거나, 지속적으로 열 충격 조건에서 단백질 집계를 수행하는 현미경 보육 인치 참고 - 당신은 RT, 사전 열 구경이 위의 모든 온도에서 현미경을 사용하는 경우현미경과 목표의 몸 (아래)를 따라 온도를 평형하는 2 시간에 관한 연구. </li></ol> 2. 판 \ 슬라이드 준비 <ol><li> 해당 판을 선택합니다. 주요 고려 사항은 영상 획득 동안 초점을 유지하는 능력입니다. 다음 점은 2D 시간이 만료 또는 3D 이미징을위한 4D 영상을위한 중요한과하지 않습니다. <ol><li> 여러 우물 판 다른 우물의 바닥 (예 : 우물이 목표에 상대적으로 다른 높이에있을 것입니다) 균일하지 않을 수 있습니다. 이 어려운 관계없이 autofocusing 기술이 사용되는, XY 포인트와 시간 지점에서 초점을 유지하기 위해 할 것입니다. </li><li> 슬라이드 자료 : 유리 대 플라스틱. 유리 바닥 슬라이드 더 Z-동질 우​​물 사이에 있지만, 더 비쌉니다. </li><li> 접시의 바닥의 두께 : 우리가 보통 coverslip 바닥 판 인덱스 1.5를 사용하지만, 인덱스 1은 목표에 따라도 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Cov10 분에 ConA (0.25 MG / ML)와 플레이트의 응급실 바닥 \ 슬라이드. ConA는 시간이 지남에 따라 하나의 셀에 따라 수 있습니다 슬라이드에 세포를 준수하는 데 사용됩니다. </li><li> ConA를 제거하고 그래서 초과 ConA이 증발하는 화학 후드에 슬라이드를 품다. </li><li> 잘 ConAed에 효모 샘플 플레이트 (200) μl (OD 600 = 0.5). </li><li> 세포 판의 표면에 충실 사용으로 15 분에 품다. </li><li> 매체의 압축을 풉니 다, 그리고 세포의 하나의 레이어를 새로운 매체로 세 번 씻어. 참고 : 긴 시간 경과를 계획하는 경우, 씨앗 세포가 띄엄 띄엄 있도록 새로운 꽃 봉오리가 작성하고 관심 지역을 방해하지 않습니다. </li></ol> 3. 현미경 준비 <ol><li> 우리는 몇 가지 표준이 아닌 수정 니콘 A1Rsi 공 촛점 현미경을 사용합니다. 최대 및 효모 영상을 위해 4 레이저 (및 640 nm의, 40 MW CUBE 레이저, 457-514 nm의, 65 MW 아르곤 이온 레이저; 561 나노 미터, 50 MW 사파이어 레이저 405 nm의, 50 MW의 CUBE 레이저)까지 사용 을 갖춘 4 PMTs필터. 우리 영상의 대부분은 EGFP를위한 녹색 필터 세트와 mCherry과 tdTomato에 빨간색 필터 세트 이루어집니다. GFP 및 mCherry과 함께 거의 bleedthrough는 없으며, 따라서 우리는 종종 동시 스캔을 사용합니다. 그러나, 라인 스캔은 또한이 발생하면 bleedthrough을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. 우리 공 촛점도 2-3초 당 Z-스택을 (30-50 절) 활성화, z는 3 밀리 초 단계를 만들 수 있습니다 PInano 압전 단계 (MCL) 구비되어 있습니다. galvano 스캐너와 공진 스캐너 - 시스템은 스펙트럼 검출기, 완벽한 초점 (레이저 오프셋), 두 개의 스캐너가 있습니다. </li><li> 적절한 목표를 선택합니다. 주요 고려 사항 : <ol><li> 물 / 오일 / 에어 목적 : 주 고려 사항은 샘플의 매체 대 영상 매체의 굴절률이다. <ol><li> 오일 목적의 장점 : <ol><li> 오일 목표는 높은 수치 개구 (석유 바꿈 물보다 더 많은 빛을, 따라서 더 많은 광자 목표로 돌아가)를 할 수 있습니다. 오일 목적은 보유 할 수 있습니다NA 1.49은 물 1.27에 비해합니다. (단,이 사실은 해상도에 큰 차이 없습니다.) </li><li> 기름의 굴절률은 유리의 굴절률과 일치, 따라서 더 광자는 목표에, 유리를 통해 샘플에서 갈 손실되지 않습니다. (참고 - 목표와 coverslip에 적합한 굴절률이 집중 오일을 선택). </li><li> 이 증발하지 않기 때문에 기름은 문제없이 오랜 시간이 만료 된 수 있습니다. </li></ol> 석유 목표의 단점 : <ol><li> 빛이 수성 매체 (예 : 셀 등)를 통해 여행을하는 경우에는 오일 목적의 높은 NA으로 활성화 높은 해상도는 빠른 속도로 떨어집니다. </li><li> 이미지는 일반적으로 구형 aberrations을 가지고는 3D에 적용 &quot;을 뻗어&quot;. </li><li> 오일은 끈적 지저분한와 목적에 해로울 수 있습니다. </li></ol></li><li> 물 목적의 장점 <ol><li> 셀 자체는 수성이며, 따라서 Z의 적은 왜곡,이 있습니다차 해상도는 수성 샘플에 높은 깊이 남아 있습니다. </li><li> 청소하고 사용자 친화적 인. 물 객관적인 단점 : 증발 빠르게 목표에 지속적으로 물을 펌프하기 위해 만들어지고 특별한 준비없이 긴 영화에 따라서 적합하지. </li></ol></li><li> 에어 목적의 장점 : 1. 어떤 물질은 여러 포인트 획득이나 긴 영화 중에 / 증발을 잃어되지 않습니다. 2. 청소하고 사용자 친화적 인. 단점 : 낮은 해상도와 낮은 신호 감도. </li></ol></li><li> 객실 및 보육 온도 : 변화하는 온도가 물질 특성에 영향을 미치는, 그리고 섬세한 시스템에 초점을 변경합니다. 온도는 취득 점수를 선택하기 전에 조정해야합니다. 취득 기간 동안 온도를 변경하면 이미지가 중단되며, 초점의 손실을 야기 할 것이다. 우리는 우리의 현미경 시스템은 이미징 전에 원하는 온도에서 2 시간에 평형 보자. </li><li> 수정 목걸이 : 많은 목표 있도록 수정 링 함께목적은 주어진 커버 슬립의 두께에 맞게 변경해야합니다. 우리는 점 확산 함수 (point spread function)를 시각화하는 형광 구슬을 사용하는 동안 보정 칼라를 조정하는 것이 좋습니다. 이 모든 샘플에 대한 올바른 설정을 보장합니다. </li><li> 안정적인 샘플 홀더 : 우리가 가장 상업적으로 사용 가능한 샘플 홀더는 현미경의 약한 부분 것을 찾을 수 있습니다. 그들은 종종 휘청과 직선 없습니다. 이 고해상도, 멀티 - 포인트 4D 영상을위한 재해이다. 우리는 직선 우리 자신의 샘플 홀더를 디자인하고 무대에 단단히 맞습니다. 필요할 때 또한 딱 할 수 있습니다. </li><li> 다 지점 인수 : 저희 이미징 시스템은 기본적으로 레이저 기반의 자동 초점 메커니즘입니다 니콘 &quot;완벽한 초점&quot;시스템을 갖추고 있습니다. 시스템이 많이 표류하지 않습니다 특히 경우 autofocusing은 4D 영상과 반드시​​ 필요하지 않습니다. </li></ol></li></ol> 4. 영상 <ol><li> 시스템을 켜십시오 : 레이저, 무대, 컨트롤러, 카메라와 compu적이 소프트웨어. </li><li> 무대 홀더에 삽입 플레이트가 제대로 확보 및 안정화. </li><li> 효모의 위치와 방향을 결정하는 눈 포트를 사용합니다. </li><li> brightfield 사용하여 모양과 질감에 따라 세포의 건강과 생존 능력을 평가합니다. </li><li> 관련 형광 (GFP에 대한 예 FITC 필터)에 따라 epifluorescent 불 켜고, 그리고 연구에 따라 달라질 수 있습니다 표현형을 표시 셀에 중점을두고 있습니다. 하나 이상의 파장에서 높은 형광 아르 세포가 죽었 따라서 autofluorescent 수 있습니다. 우리는 SV40 NLS 신호 (NLS-TFP)에 융합 tdTomato의 형광으로 핵을 표시합니다. TFP 두 번 GFP의 크기이며, 핵의 확산 한도를 초과 따라서이며, 따라서 그것은 핵 마커로 잘 작동합니다. 우리는 또한 GFP로 동시에 녹색 (488 nm 정도) 레이저 TFP을 자극하지만, 스펙트럼 해결을위한 두 개의 별도 PMTs에 녹색과 붉은 배출량을 수집 할 수 있습니다. </li><li> 소음을 최소화하기 위해 다음과 같은 설정을 조정및 oversaturation : <ol><li> 레이저 전원 - photobleaching 및 이미지의 광독성 대 밝기 고려되어야한다. </li><li> 게인 : 카메라 감도에 영향을 미치는, 따라서 잡음 비율로 신호. </li><li> 핀홀 지름이 - 짧은 파장과 레이저에 따라 조정해야합니다. 핀홀 직경은 광학 부분의 두께 (높이)가 이미징를 결정합니다. 따라서, 핀홀을 열어이 더 빛을 (더 많은 광자하게)를 수집되지만, Z (이하 confocality)에서 해상도를 줄인 것입니다. </li></ol></li><li> 유용한 팁 : <ol><li> 다른 fluorophores가 일치 파장을 방출하는 경우, 가상 필터의 선택을 가능하게 스펙트럼 탐지기 기능을 사용합니다. 스펙트럼 감지기는 일반 PMTs보다 문자를 구분합니다. </li><li> 다른 fluorophores가 같은 레이저로 흥분하는 경우, 라인 스캔 기능을 사용합니다. </li><li> Galvano 스캐너 더 감도를 가능하게하지만, photobleaching에 대한 높은 위험이 있습니다. 공진 스캐너가 빠른 수cquisition는, 따라서 photobleaching에 대한 위험을 낮출 수 있지만, 덜 민감하다. </li><li> 이미지 2 ~ 16 평균, 소리의 비율로 신호를 향상하지만, 물론, 인수가 느린와 만드는, 레이저에 샘플 더 많이 노출을 포함한다. </li><li> 기간 생물학적 질문 (예 : JUNQ 및 iPod 형성은 ~ 2 시간이 소요)에 인수 - 따라 달라집니다. 우리는 시간이 경과 3D로 최대 30 시간까지의 공진 스캐너와 효모를 이미징하고 있습니다. </li><li> 시간 경과 간격 - 작은 간격은보다 일관된 동영상을 만들 수 있지만, 표백, 따라서 신호의 손실 사진을 발생할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

생화학 프로세스에 대한 우리의 직관이 반응물 및 제품의 잘 혼합 솔루션 비커에 평형에 도달 할 수되는 벤치 탑 실험에서 도출. 이러한 설정에서 특정 화학 종의 농도는 매크로 볼륨 분자의 몰 수량의 비율 인 하나의 숫자로 표현 될 수 있습니다. 세포의 전체 인구의 homogenates에서 추출을 수행 서부 blots, centrifugations, 그리고 분광 측정 : 많은 우리가 단백질 구조와 기능에 대해 알고 무엇의 고전, 대량 반응 사진을 반영 방법을 사용하여에서 유래. 우리가 배율에 따라 세포를보고 사용하는 기술로 도약하고 경계에 의해 향상은 대부분의 생화학 반응이 생체에서 개최되는 조건이 고전 벤치 탑 시나리오의 사람들 만이 조금 닮았 그런 적 명확하게된다. 뿐만 아니라 cel의 내부입니다라는 밀도가 크롤링 효과가 실질적으로 다양한 반응물의 활동을 변경하는, 또한 잘 혼합의 정반대이며, 환경을 포장. 체외의 복잡한 macromolecular 반응 폭 넓은 범위의 생체 효율성의 사이에 자주 차이에 대한이 차지한다. 아무데도 생체 폴딩, misfolding, 그리고 단백질의 집계에 관련된 질문에서와 같이 오해를 더 쉬운 체외 생화학 실험 클래식에서 형태소 분석 직관이 없습니다. 대량 반응 단백질 화학의 연구 간단한 예, 아니오로 답하는 등의 특정 단백질에 대한 개고의 문제를 처리 할 수​​ 있습니다 반면, 라이브 셀에 고분자 전체 인구의 역학을 추적 할 시도가 가능한 전체 배포에 민감해야합니다 폴리펩티드 사슬을 사용할 수 conformational 결과와 misfolding 및 집계의 위험에 특히. 예를 들어, 우리는 대량 셀 리를 검사 할 수서쪽은 blotting하여 집계 단백질 물리게하다, 그리고 단백질이 대부분 불용성 및 ubiquitinated 아니라는 것을 확인하십시오. 그러나, 생활 셀에 여러 셀을 통해 평균 때를 검출하기 어려운, 단백질의 하위 인구 이산, 가용성 및 종의 로컬 농도가 매우 높은 특정 구획에 ubiquitinated 수 있습니다. 후자의 시나리오는 큰 대량 하위 인구보다 세포의 생존에 대한 더 많은 중요한 결과가 초래 될 수 있습니다. 보호자가 pleiotropic 행동과 체외에서 기능을 다양하게 표시 반면 또한,이 셀에 자신의 분리 기능이 spatially과 시간적으로 국한하는 증거가되고있다. 생화학을 이해 새롭게 새로운 패러다임에서, 농도는 세포의 나노 환경 각각의 변수 재산되고, 생물학적 과정을 기초 분자 이벤트뿐만 아니라 시간에 assayed해야합니다뿐만 아니라, spac에5. 여기에 제시된 4D 영상 방식은 다른 생물학적 과정의 수를 연구하는 데 사용할 수있는 방법과 그들이 시간, 공간에 규제 있지만, 라이브 셀의 단백질 misfolding의 민감한 모델링을 가능하게하고, 환경 조건의 변화에​​ 따라. 이 논문에서 우리는 효과적으로 세포 기질의 단백질 응집체의 발병에 대처하는 단계와 옵션을 보여줍니다 Ubc9 TS 접는 센서를 사용합니다. 집계 품질 관리의 세포 생물학을 도시뿐만 아니라, 이러한 방식은, proteostasis (예를 들어 Ubc9 TS는 산화에 대한 응답으로 단백질 접힘 스트레스를 측정하는 데 사용할 수 있습니다에서 특정 섭동 또는 유전자 변이의 영향을 파악하기위한 강력한 도구로 제공 할 수 품질 관리 경로에서 유독 집계, 또는 변이)의 표현. 4D 영상을 정확하게 두 개의 서로 다른 단백질 간의 단백질 현지화 또는 colocalization를 결정하는도 중요합니다초, 그리고 어쩌면 과도하지만 중요 현상을 검출하기위한. 예를 들어, 특히 효모와 같은 작은 구형 유기체으로는, 4D 영상이 단순히 검사의 각도의 유물입니다 나타날 수 있습니다 반면 구조 또는 누계는 juxtanuclear 현지화을 가지고있는 경우로 나타날 수 있습니다. 우리가 여기에 제시 예를 들어 실험에서, 우리는 모델의 사용은 세포 기질의 시간과 공간에 대한 집계 품질 관리를 수행하는 단백질, Ubc9 TS를 misfolded 보여줍니다. 허용 온도에서 Ubc9 TS 가운은 개 어져 있으며, 핵 및 세포 기질에 확산. 열 유도 misfolding하면, 그것은 처음에 빠르게 proteasomal 저하에 처리됩니다 diffusing 작은 집계 스트레스 Foci을 형성한다. proteasome가 부분적으로 억제 될 때, 이러한 스트레스 Foci는 약 2 시간에 걸쳐 JUNQ 및 iPod 함유로 변환됩니다. ubiquitin로 인한 오염은 품질 관리 옵션, UB 등을 사용할 수없는 경우C9 TS는 즉시 보호 집계에 아이팟 포함에 다시 라우팅됩니다. 이 도구는 집계 품질 관리에 관련된 소설 유전 요인을 발견하고, 세포에서의 공간과 시간적 규정을 둘러 놀라운 기회를 제공합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>mbs474790</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>con A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom plates</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>ibd81158</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation 
			Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d imaging of protein aggregation in live cells

모든 살아있는 세포의 주요 작업 중 하나는 끊임없이 변화하는 환경 조건과 세포 내 환경을 단단히 포장되어, 끈적하고, 단백질의 안정성 1 위험한의 얼굴에서 새롭게 합성 단백질의 적절한 접는을 유지하고 있습니다. 동적으로 단백질 생산, 접이식 및 저하의 균형을 할 수있는 능력이 누구의 절대 필요성 때 오작동 가장 관찰이 높은 전문 품질 관리 기계를 요구합니다. 이러한 ALS, 알츠하이머, 파킨슨, 그리고 낭포 성 섬유증의 특정 형태의 질병은 단백질 폴딩 품질 관리 구성 요소 2에 대한 직접 링크를 가지고 있고, 따라서 향후 치료 개발 기본 과정의 기본적인 이해를 필요로합니다. 우리 실험 과제는 세포가 손상 신호를 통합하고 다양한 상황에 맞게 조정됩니다 답변을 마운트 방법을 이해하는 것입니다. 단백질 misfolding은 실존 thre를 나타냅니다 왜 주된 이유셀에서 총에 잘못 접 단백질의 성향에 따라서 혼잡하고 섬세 세포 접이식 환경 (1)의 글로벌 섭동의 원인입니다. 접는 건강, 세포 프로테옴의 &quot;proteostasis은&quot;정교한 품질 관리 시스템 3,4에서 다른 기계론의 단위의 조율 된 행동에 의해, 심지어 노화, 스트레스와 산화 손상의 협박, 유지됩니다. 분자 보호자의 전문 기계가 아닌 기본 polypeptides을 구속하고 기본 상태 1로 자신의 접이식를 홍보 할 수 있습니다, ubiquitin-proteasome 시스템 (5)에 의해 저하 위해 타겟팅, 또는 보호 집계 함유 6-9로 안내. juxtanuclear 품질 관리 구획 (JUNQ)과 불용성 단백질 보증금 (아이팟) (- 모델 그림 1) : eukaryotes에서 cytosolic 집계 품질 관리 하중은 두 개의 구획 8-10 사이에 분할됩니다.단백질 접힘 품질 관리 기계에 의해 ubiquitinated 아르 단백질들은이 proteasome에 의해 저하에 대한 처리 JUNQ에 전달됩니다. ubiquitinated되지 Misfolded 단백질들은 적극적으로 보호 구획에 집계됩니다 아이팟에 우회하고 있습니다. 최대이 시점까지, 라이브 세포 형광 현미경의 방법 론적 패러다임은 주로 라벨 단백질로 된 두 개의 차원에 시간 포인트와 보통 특정의 셀에 자신의 위치를​​ 추적 할 수 있습니다. 새로운 기술은 살아있는 세포에 experimenters에게 submicron 규모에 전례없는 액세스 권한을 부여 할 시작으로, 세포 기질의 동적 아키텍처는 실험 특성에 대한 도전 뉴 프런티어로보기에왔다. 우리는 빠른 속도로 시간이 지남에 따라 효모 세포 기질에 여러 휘황 표시된 단백질의 3D 공간 배포판을 모니터링하기위한 방법을 제시한다. 3D timelapse (4D 영상)는 단순히 기술적 인 도전이다; 쥐그녀 또한 세포 구조를 분석하는 데 사용되는 개념적 프레임 워크에 극적인 변화를 용이하게한다. 우리는 빠른 4D 형광 이미징을 사용하여 세포 집계 품질 관리에 misfolded 단백질의 고유 한 운명을 시각화하는 라이브 효모에서 cytosolic 접이식 센서 단백질을 사용합니다. Ubc9 단백질 10-12 (Ubc9 TS)의 온도에 민감한 돌연변이 세포 proteostasis의 센서, 및 추적 집계 품질 관리에 대한 생리 학적 모델을 둘 다 매우 효과적입니다. 대부분의 TS 단백질과 마찬가지로, Ubc9 TS가 활성화 세포 보호자에 의해 허용 온도에서 완전히 접힌과 기능입니다. 30 위 ° C, 또는 셀 misfolding 스트레스, Ubc9 TS의 misfolds을 향해 있으며 돌연변이, 열 변성, 또는 산화 손상으로 인해 misfolded 된 기본 구상 단백질의 운명을 다음과 때. 그 스트레스 Foci을 형성하거나, 그대로 융합하여 GFP 또는 기타 fluorophores에는,이 3D로 추적 할 수 있습니다 디JUNQ 또는 iPod에 rected.

<html><img alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> 1 그림. . 품질 관리 기계는 독특한 기능을 가진 서로 다른 구획으로 misfolded 단백질을 지휘 misfolded 단백질의 하위 세포 compartmentalization : 모델 가용성식이 단백질, 저하에 대한 타겟, 폴리 ubiquitination를 받아야하고 주 xta-N uclear Q의 uality 제어 구획 (JUNQ로 전송됩니다 ). 그들은이 활성화 집계를 받아야 곳 ubiquitinated 할 수없는 불용성 단백질은 액포에 인접 I nsoluble 저얼 otein D eposit (아이팟),에 보호 격리에 전송됩니다. es.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. GFP-Ubc9 TS로 모델링 단백질 misfolding. 정상적인 조건에서 GFP-Ubc9 TS (녹색)은 기본적으로 접혀 있으며, 핵 및 세포 기질에 diffusely 지역화되어 있습니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. Ubc9 TS의 표현은 모든 실험에서 이미징 전에 2 %의 포도당의 추가에 의해 종료되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol><li> 37 온도 변화시 ° C, GFP-Ubc9 TS (녹색)가 misfolded과 cytosolic 스트레스 Foci을 형성하고 있습니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. </li><li> 23 ° C에서 열 충격에서 회복되면 열 denaturated GFP-Ubc9 TS는 타락 등 감소 형광 수준으로 표시. </li><li> 80 음 MG132, GFP-U와 37 ° C 및 proteasome 억제에 온도 변화시<html> bc9 TS는 JUNQ 및 iPod 함유로 misfolded 처리됩니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. </li><li> 37 온도의 변화에 따라 ° C와 ubiquitination 억제, GFP-Ubc9 TS 아이팟 포함에 misfolded 처리됩니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. Ubiquitin 단백 분해 효소 4 (Ubp4)이 Ubc9 TS의 ubiquitination를 차단하도록 overexpressed 있습니다. </li></ol><img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> 그림 3. JUNQ 및 iPod 형성 시간 경과. 37 온도 변화시 ° C 80 음 MG132과 proteasome 억제가 GFP-Ubc9 TS 스트레스 Foci가 JUNQ 및 iPod 함유로 처리됩니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. 3D 이미지는 4 분 간격으로 획득했다. (또한 영화 1 참조).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

세포 생존 능력은 단백질 misfolding의 적시에 효율적 관리에 따라 달라집니다. 흠의 refolding, 열화, 또는 격리 : 우리는 여기 misfolded 단백질의 다른 잠재적 인 운명을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Ubc9, 접이식 센서의 사용을 보여줍니다<sup&gt; TS</sup&gt;, 모니터링 proteostasis와 4D의 현미경을 사용하여 라이브 셀의 집계 품질 관리를위한.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.2K 조회수.  Hebrew University of Jerusalem. 세포 생존 능력은 단백질 misfolding의 적시에 효율적 관리에 따라 달라집니다. 흠의 refolding, 열화, 또는 격리 : 우리는 여기 misfolded 단백질의 다른 잠재적 인 운명을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Ubc9, 접이식 센서의 사용을 보여줍니다 TS, 모니터링 proteostasis와 4D의 현미경을 사용하여 라이브 셀의 집계 품질 관리를위한.

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Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

연구

생물학

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

효모의 4D 현미경 검사법

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...