다당류는 단백질에 연결되지 않는 한 면역원성이 좋지 않으며 단백질에 대한 유도 또는 융합을 위해 활성화될 필요가 없습니다. 이 방법에서 CDAP는 모래 를 하는 시약으로 사용됩니다. CDAP는 파생용 다당류 하이드록실을 활성화하거나 백신 또는 진단 시약에 사용하기 위해 단백질과 연결됩니다.
CDAP는 주로 다당류 모래 사락 시약으로 시아노겐 브로마이드를 대체했다. CDAP는 더 간단하게 사용하기 쉽고, 더 효율적이며, 시아노겐 브로마이드보다 더 낮은 pH에서 사용할 수 있습니다. 그것은 훨씬 더 나은 활성화 시약입니다.
CDAP는 대부분의 다당류와 함께 사용할 수 있습니다. 화학은 단백질에 직접 및 간접적으로 수렴하는 데 사용할 수 있으며 진단 시약을 만드는 데 사용할 수 있습니다. CDAP 활성화 반응은 원래 설명된 바와 같이 매우 빠르고 제어하기 어려웠습니다.
여기에 제공된 프로토콜은 화학을 훨씬 쉽게 수행하고 훨씬 더 재현 할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에, 교반하는 동안 디메틸 아미노피리딘 스톡 용액 200 마이크로리터를 첨가하여 다당류 용액의 pH를 9로 조정한다. 활성화의 전체 과정에 대한 얼음 물 욕조에서 반응을 차가운 유지.
교반하는 동안 CDAP의 100 마이크로리터를 다당류 용액으로 전송하여 시아노-디메틸아미노피리딘-테트라플루오로보라테 또는 CDAP 활성화를 진행한다. 타이머를 시작하고 전체 활성화 중에 pH 변경 사항을 15분 동안 모니터링합니다. 0.1 어금량 나트륨의 10 마이크로리터 증분을 신속하게 추가하여 대상 pH에서 반응을 유지한다.
최적의 활성화 시간에 도달하면 활성 폴리사카라이드에 0.5 개의 어진 이질이 있는 2밀리리터를 한 번에 추가합니다. pH가 수산화 기능화를 위해 필요한 범위에 있는지 확인합니다. 반응 혼합물을 1시간 이상 연속 교반한 후 반응 혼합물을 섭씨 4도로 옮기는다.
제품으로부터 ADH 농도를 줄이기 위해 투석 장치를 사용하여 원유 파생 다당류 용액을 투석합니다. 투석에서 파생된 다당류를 회수하고 다당류 및 히드라지드의 농도를 결정하여 다당류 비로 히드라지드를 계산한다. 표준으로 사용할 밀리리터 수정되지 않은 다당류 용액당 1밀리그램을 준비합니다.
안정적인 균일 한 온도를 달성하기 위해 최소 1 시간 동안 140섭씨140도로 가열 블록을 예열합니다. 산이 유출되는 경우 난방 블록 아래와 주변의 보호 패드를 사용하십시오. 밀리리터 탄수화물 표준당 1밀리그램의 다양한 볼륨을 트리클리케이트 13x100의 보로실리케이트 테스트 튜브에 추가하고 원하는 표준 농도를 달성하기 위해 물로 100 마이크로리터로 볼륨을 구성합니다.
마찬가지로, 3개의 견본관에 파생된 다당류의 5마이크로그램을 포함하는 부피를 추가하여 견본을 설치합니다. 각 튜브에 밀리리터 레소시놀당 갓 준비된 6밀리그램의 마이크로리터 100마이크로리터를 추가합니다. 반복 피터를 사용하여, 각 튜브에 준비된 75% 황산의 300 마이크로리터를 추가하고, 튜브를 적극적으로 소용돌이치며, 튜브를 가리키는 다음, 모든 튜브를 순차적 순서로 꾸준한 속도로 히터 블록에 넣고 즉시 3분 동안 타이머를 설정합니다.
3분 만에 튜브를 같은 순서로 제거하고 얼음 수조의 랙에 직접 놓습니다. 얼음 차가운 튜브를 제거하여 실온에 5분 동안 평형화할 수 있습니다. 10mm 길이의 큐벳을 사용하여 430 나노미터의 UV-Vis 분광광미터에서 모든 튜브의 흡광도를 읽어보십시오.
분석 반응을 설정하려면 농도가 증가하는 순서대로 튜브 랙에 표지된 표준 튜브를 정렬하고 정렬합니다. 보정된 마이크로파이프를 사용하여 각 해당 튜브에 표준 100 마이크로리터를 추가합니다. 제로 표준의 경우 샘플 버퍼의 100 마이크로리터를 사용합니다.
마찬가지로 샘플 튜브를 준비하고 정렬합니다. 그런 다음 보정된 1, 000 마이크로리터 마이크로파이프를 사용하여 모든 분석 튜브에 875 마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 분석 반응을 시작하려면 5분 이내에 각 분석 관에 1%트리니로벤젠 설포닉산의 25마이크로리터를 첨가한다.
고속으로 2초 동안 분석관을 소용돌이치며, 액체가 튜브 개구부에서 반 인치 높이로 소용돌이치는지 확인합니다. 분석 시작 시간을 기록하고 타이머를 2시간으로 설정합니다. 그런 다음 실온에서 2 시간 동안 분석 튜브 랙을 어둠 속에서 놓습니다.
시간이 끝나면 튜브를 소용돌이쳐 데이터 수집으로 진행합니다. ADH dextran은 레소시놀 황산 분석제를 사용하여 dextran에 대해 분석되었다. 설탕 표준으로 포도당을 사용 하 여 전형적인 표준 튜브 플롯 되었다.
유도된 다당류 또는 덱스텐의 히드라지드 함량은 TNBS 분석체를 사용하여 결정되었다. 파생수준은 다른 평균 분자량의 폴리머 간의 비교를 용이하게 하기 위해 100킬로톤당 수화물로 계산되었다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 다당류에 맞게 조정되어야 할 수 있다.
CDAP 화학은 다양한 컨쥬게이션 시약과 함께 사용하기 위해 다당류를 기능화하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ELISA에서 사용하기 위해 다당류를 바이오티니트하는 데 사용할 수 있습니다. 단백질은 CDAP 활성화 다당류에 직접 연결될 수 있습니다, 그러나 이것은 일반적으로 특정 polysaccharide를 위한 몇몇 최적화를 요구합니다.
컨쥬게이션 수율은 75% 이상일 수 있으며 CDAP 화학의 사용은 인도 혈청 연구소가 만든 것과 같은 저비용 컨쥬게이트 백신을 가능하게 했습니다.
