이것은 표적으로 한 항체 중화와 DCAF 분자를 합성하는 방법에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 돕도록 봉사할 수 있습니다. 이 기술은 높은 생산성으로 DCAF 분자를 합성하는 가장 간단한 방법을 제공합니다. 세계는 DCAF 분자가 뎅기열 과 근상증과 같은 질병을 다루는 항체에 잠재적인 내정간섭이 있다는 것을 결정합니다.
이 방법은 톱니상 항체를 표적으로 하기 위하여 상이한 전형체를 가진 그밖 DCAF 분자에 적용될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 수석 기술자 인 Xue Bai가 될 것입니다. 2-염소 수지를 펩타이드 합성 용기의 상단에서 2-염소 수지유래 수지로 변환하려면 2-염소 수지의 0.25 밀리몰에 DMF 5 밀리리터를 추가합니다.
캡을 다시 켜고 15초 동안 부드럽게 용기를 흔들어 철판에 배출합니다. DMF 세척을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 배에 DCM 5 밀리리터를 넣고 캡을 다시 켜고 15초 동안 부드럽게 용기를 흔들어 철판에 배출합니다.
DCM 세척을 두 번 더 반복한 다음 DMF 세척을 세 번 더 반복합니다. 다음으로 DCM에 DMF의 50% 부피 농도의 6밀리리터를 추가하여 30분 동안 수지를 팽창시키고 배수합니다. 이제 수드라진과 DMF의 5%의 부피 농도의 6밀리리터를 반응 용기로 이송합니다.
셰이커에 120 RPM과 섭씨 30도에서 30분간 30분간 놓고 진공 펌프로 용액을 배출합니다. Fc-III 펩타이드의 수드라진 유도체를 정화하려면 HPLC 시스템을 사용하여 분당 1밀리리터의 유속으로 30분 그라데이션 용출으로 펩티드를 정화합니다. 원고에 따른 단백질 정제 후, 밀리리터 SUMO 태그 단백질 당 1 밀리그램의 새로운 튜브 2 밀리리터, SUMO 프로테아제 1밀리리터, 10X SUMO 프로테아제 버퍼 1밀리리터, 이중 증류수 6밀리리터를 추가하여 반응 용액을 준비합니다.
4섭씨에서 12~16시간 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 혼합물을 8 개의 1.5 밀리리터 Eppendorf 튜브로 알리쿼트하고 혼합물을 섭씨 4도에서 10 분 동안 15, 000 배 G에서 원심 분리합니다. 파이펫을 사용하여 하단의 골재를 폐기한 다음 10 밀리리터 클리어 슈퍼나티에 넣고 50 밀리플러 PBS에 50% 니켈 NTA 비드 슬러리 0.5 밀리리터를 추가합니다.
튜브를 회전 셰이커에 200 RPM과 섭씨 4도에 놓고 60분간 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 리사데와 니켈 NTA 혼합물을 바닥 콘센트 캡이 있는 컬럼에 적재한다. 하단 캡을 제거하고 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 흐름을 저장합니다.
HIS 태그 SUMO 단백질은 컬럼에 결합합니다. 네이티브 화학 결찰 반응을 위한 CIS로 시작하는 링커 항원 부분은 관통하는 흐름에 있습니다. 이제 무게 1.8 2 밀리리터 에펜도르프 튜브에 Fc-III 펩타이드의 수드라진 유도체의 무게 1.8 밀리그램과 pH 3에서 0.2 어금니화 인산염 용액에 6개의 어금니 구아니듐 염화물의 0.8 밀리리터를 추가합니다.
분말을 용해 하는 소용돌이. 7에서 튜브를 원심 분리 한 후, 실온에서 1 분 동안 200 배 G는 새로운 튜브로 상체를 전송합니다. 튜브에 교반 바를 넣고 튜브를 자기 교반기위에 얼음 소금 욕조에 넣고 15 분 동안 부드럽게 저어줍니다.
그런 다음 용액에 0.5 개의 어금니 나트륨 아질산염의 40 마이크로 리터를 추가하여 하이드라진 그룹을 산화시하십시오. 얼음 소금 목욕에서 15 분 동안 용액을 부드럽게 교반하십시오. HPLC의 11 밀리그램에 무게를 정하고 건조 된 링커 항원 부분을 동결, 그리고 13.6 얼음 소금 목욕의 반응 튜브에 MPAA의 밀리 그램.
5분간 저은 다음 6개의 어금니 나트륨수산화물로 방온화시 pH 값을 6.8~7.0으로 조정합니다. 네이티브 화학 적 결찰에 대한 가장 중요한 단계는 pH 값을 신중하게 조정하여 결찰 반응을 시작하는 것입니다. 얼음 소금 목욕에서 12 시간 후, 반응 시스템에 0.1 어금니 TCEP 중립 용액의 0.4 밀리리터를 추가하고 20 분 동안 저어 반응을 종료합니다.
원심분리 및 HPLC 정제 후, 탈황을 위한 공주 피크 III를 얻습니다. 0.2 어금니 나트륨 인산염 용액에 6개의 어금다과니듐 염화물50 마이크로리터에 녹입니다. 그런 다음 어금니 TCEP 1개, 테르트 부틸티올 10마이크로리터, 4가지 용액에 0.1 마이크로리터 5개를 추가합니다.
용액의 최종 pH를 6.9로 조정하고 약 5시간 동안 셰이커에서 섭씨 37도까지 용액을 유지합니다. 원심 분리기를 다시 정화합니다. 준비된 펩티드를 32밀리머 실버 아세테이트의 200마이크로리터에 녹인 다음, 4시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 저어줍니다.
펩타이드의 은틸레이트를 프리 티올로 변환하려면 6개의 어금니 구니듐 염화물에 1개의 어금다 DTT의 마이크로리터 3개, pH 7에서 0.2개의 어금니 모노나트륨 인산염을 첨가한다. 전체 스캔 모드에서 질량 분광계를 작동하고 m/z 범위를 300에서 2, 000으로 설정하고 해상도를 60, 000으로 설정합니다. 질량 스펙트럼 데이터를 열고 각 단계에서 제품의 피크를 찾아 화학 반응이 성공적으로 수행되고 있는지 확인합니다.
DCAF1과 4G2 항체 간의 상호작용에 대한 ELISA 분석을 수행하기 위해, 코팅 완충제의 100 마이크로리터에서 안티 GST 항체의 피코몰 1개를 가진 96웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰을 코팅한다. 밀봉 테이프로 접시를 밀봉하고 셰이커에 하룻밤 4도에서 배양. 아침에 는 1 %BSA및 PBS의 200 마이크로 리터와 함께 각각 잘 차단합니다.
접시를 밀봉하고 셰이커에 1 시간 동안 방 온대인을 인큐베이션하십시오. 그런 다음 0.05 %의 Tween 20을 가진 PBS를 사용하여 각각 4 번 잘 씻습니다. 이 프로토콜에서 네이티브 화학 적 결찰 방법은 DCAF1 분자의 반합성을 위해 사용되었다.
질량 스펙트럼은 최종 DCAF1 분자가 11, 053의 분자 무게를 갖는다는 것을 보여줍니다. ELISA 분석 중, 항원 펩티드 Fc-III 및 DCAF1은 4G2 항체 결합을 경쟁적으로 억제한다. 항원 펩티드와 DCAF1 모두 4G2 결합을 현저히 차단한 반면 Fc-III 펩티트는 항원 항체 상호작용에 영향을 미치지 않았다.
이 발달 후에, 이 기술은 유해한 항체 관련 질병의 내정간섭을 위한 도로를 포장했습니다. 펩티드 합성 및 네이티브 화학 결찰에 사용되는 영역의 Lot's는 매우 독성이 있다. 화학 후드에 이러한 실험을 해야 합니다.
