우리가 여기에서 상세히 설명하는 절차의 전반적인 목표는 신코티컬 발달 도중 1 차적인 cilium의 참여를 해부하는 것입니다. 1 차 적인 섬모는 전조 세포 확장, 운명 결정, 신경 이동 및 성숙을 포함하여 신피성 발달의 많은 단계에 대한 결정적인 표시되었습니다. 신코르피컬 개발 중 세포 개입을 더욱 해부하기 위해 신코테컬 개발의 신흥 2D 및 3D iPS 세포 기반 모델을 활용하여 관련 도구를 설정했습니다.
즉, 신경 장미와 등쪽 전뇌 오르가노이드. 3D iPS 세포 기지를 둔 모형은 배아 바디 형성으로 시작합니다. 말의 배아 체의 접착은 2D 신경 로제트 구조물의 생성을 허용하고, 이러한 EB의 자유 부동 문화는 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성을 허용합니다.
대뇌 오르가노이드를 생성하기 위해 설정한 프로토콜은 이중 SMAD 억제라고도 하는 활성질 노달 및 BMP 경로의 억제제를 사용하여 도럴 전뇌 오르가노이드를 구체적으로 생성하기 위해 미리 패터닝 인자를 추가하여 재갈 방법을 사용하여 이전에 게시된 프로토콜을 기반으로 합니다. 오르가노이드의 3D 조직을 활용하기 위해 간단하고 빠른 방법을 설정하여 고해상도로 전체 오르가노이드의 총 면역 라벨링, 지우기 및 조명된 획득을 가능하게 했습니다. 그리고 1차 실륨 생물 발생 및 기능에 초점을 맞추기 위해, 우리는 진동으로 절단된 자유 부동 섹션에 면역 히스트토케화학을 적용했습니다.
면모를 제거하고 절개한 후 공명 스캐닝 공초점 현미경 검사를 사용하여 이미지를 획득했습니다. iPS 세포 배양으로 시작하여 10% 미만의 분화를 나타내며 80% 이하의 규정을 준수하지 않습니다. 바늘을 사용하여 각 iPS 세포 식민지를 수동으로 해부하여 각 식민지를 수평 및 수직 방향으로 정확하게 잡을 수 있어 각 식민지를 동일한 클러스터로 나누어 체크 무늬 패턴을 만듭니다.
세포 스크레이퍼를 사용하여 식민지를 분리하고 초저 부착 배양 판에 옮겨 놓습니다. 배아 체를 형성할 수 있도록 인큐베이터에서 하룻밤 동안 떠있게 하십시오. 다음 날, 배지를 돌려 배아 체를 흡인하지 않도록 주의하고, 신경 장미가 형성될 때까지 폴리 L-ornithine Laminine 코팅 요리로 옮겨넣습니다.
약 12~14일이 소요됩니다. 매일 새로 고침 유도, 중간, 신경 로제트 구조의 형성에 대한 현미경에서 확인. 이 단계에서, 신경 장미는 분리된 신경 줄기 및 선천성 세포 배양을 얻기 위하여 면역 염색 분석을 위해 확장, 분화 및 처리될 수 있습니다.
우선, 10% 미만의 분화를 나타내고 단층층에서 거의 한 번 통과된 대규모 일반 식민지를 수용하는 iPS 문화로 시작합니다. 0일째에 iPS 세포가 eJ2의 낮은 농도와 hiiPS 세포 생존에 필요한 고농도의 ROCK 억제제를 포함하는 EB 배지에서 배아 체를 형성하여 중간 변화 없이 3일 동안 EB 형성 인큐베이터 플레이트를 방해하지 않도록 할 수 있도록 한다. 3일째에, EB는 약 400 마이크로미터를 측정하고 정규 국경을 보여주어야 합니다.
과거의 기준이 대부분의 EB에 풍부하면 이중 SMAD 억제제가 함유된 유도 배지로 배지를 변경하여 콘트라 DB를 최상의 6~7개로 밝게 하여 신경 토말리 양보를 나타냅니다. 그리고 그들은 총 요인 감소 지하 막 메트릭으로 다른 DB를 켭니다. 이 단계에서 항상 멸균 가위를 사용하여 소화체의 개구부를 사용하여 오르가노이드의 손상을 방지합니다.
먼저 임상 튜브에 약 15 개의 오르가노이드를 전달합니다. EB는 유도 매체 2의 50 마이크로리터에서 배지를 정착시키고 제거하고 100 마이크로리터의 매트릭스를 포함하는 미세민감성 튜브로 유기체를 이송하고 위아래로 배관하여 균질화하게 한다. 중성 부착 판의 우물의 중앙에 혼합물을 확산.
그리고 마지막으로, 그들은 융합을 피하기 위해 서로 만지지 않도록 공간 EBs. 이 물질을 인큐베이터에서 45분 동안 굳게 하고, 유도 매체 2를 각 우물에 추가하고 인큐베이터에 인큐베이션을 넣습니다. 격일로 2개의 유도 를 새로 고칩니다.
17일, 지하 멤브레인 매트릭스를 5ml 파이펫으로 10회 위아래로 피펫으로 수동으로 분리합니다. 영양 흡수를 향상시키기 위해 교반 하에 번역 매체 1에서 오르가노이드 플레이트를 배양합니다. 중요한 것은, 부착 된 iPS 세포 성장에 해로운 진동을 피하기 위해 궤도 셰이커에 고정 문화와 문화에 대한 다른 인큐베이터를 사용합니다.
고정 후, 투과성, 1차 및 이차 항체와의 차단 및 배큐베이션은 세척 단계를 포함하여 10 일이 걸립니다. 우리가 선호하는 청산 방법은 글리콜 유도체인 TDE에 의존합니다. 최적의 클리어링을 위해 TDE 용액의 오르가노이드를 각각 24시간 동안 점차적으로 증가시면 비가노이드를 삽관합니다.
오르간성 포함의 경우, 메스를 사용하여 팁이 잘린 1ml 주사기로 만든 맞춤형 메인 몰딩 시스템을 사용하십시오. 녹는 온도는 섭씨 약 60도에 불과하기 때문에 낮은 융점 아가로스가 권장됩니다. 60% TDE 용액으로 4% 낮은 녹는 아가로즈를 준비하고 물베이스 사전 오르가노이드 포함시 섭씨 약 37도를 식힙니다.
플런저를 사용하여 젤 용액의 주사기 600 마이크로리터에 넣고 샘플을 배치하고 젤 용액의 400 마이크로리터로 주사기를 채웁니다. 젤을 중합하게 하고 마지막으로, 시료는 겔 내에서 이상적으로 장착되고, 비춰진 챔버 내에서 쉽게 밀어내고 목표 앞에 오르가노이드를 배치할 수 있다. 빛형 현미경 검사는 그러한 명확한 오르가노이드의 첫번째 화상 진찰에 이상적입니다.
우리는 사진 이미징을 줄이고 세포 이하 해상도의 무게를 측정했습니다. 여기서, 우리는 우리의 청산 방법의 굴절지수에 정확하게 적응할 수 있도록 샘플 챔버에 추가된 80% TDE 용액에 침수된 20배 목표를 사용했습니다. 가장 큰 샘플 순서는 시료 순서가 목표 앞에 오르가노이드를 배치하기 위해 장착되면 작동 할 수있는 플런저와 상단에서 삽입 할 수있는 1 밀리리터 주사기를 수용하도록 설계되었습니다.
전체 오르가노이드를 획득하는 데 약 5~10분이 소요됩니다. 자유 부동 섹션에 면역 염색을 위해, 수집하고 섭씨 4도에서 하룻밤 4 인 분에 오르가노이드를 수정합니다. 비동기를 사용하여 비동기를 사용하여 비구를 4% 저용 아가로즈 및 섹션에 포함시켜 PBS 용액으로 전송된 6개의 섹션 중 150마이크로미터를 획득하여 페인트브러시를 사용하여 손상을 입히는 것을 방지합니다.
투과 및 차단 후, 섭씨 4도에서 밤새 1 차 항체와 자유 부동 섹션을 배양하 하 고 동요 하에. 실내 온도에서 2 시간 동안 및 동요 하에 이차 항체로 잠복하기 전에 섹션을 주의 깊게 씻으면하십시오. 마지막으로, 최적의 클리어링을 위해 TDE 솔루션의 섹션을 60%TDE에서 1시간 30분 동안 점진적으로 증가한 다음 실온에서 하룻밤 사이에 80%TDE로 배양합니다.
이 섹션을 섭씨 80% TDE 및 TLAC 솔루션에 섭씨 4도에 저장합니다. 세포 챔버에 프리 플로팅 섹션을 마운트하여 80%TDE 용액으로 샘플을 유지하기 위해 노력하고 임상 현미경의 전동 단계에 적응하도록 설계되었습니다. 먼저, 챔버에 둥근 커버 슬립 을 넣고 페인트 브러시를 사용하여 명확한 보호를 조심스럽게 전달합니다.
챔버를 80% TDE 솔루션으로 채운 다음 표준 커버 슬립 2개와 2차 커버 슬립 1개와 실리콘 씰을 추가합니다. 마지막으로, 완벽하게 시스템을 밀봉 챔버의 나사 링에 나사. 나이트시트뿐만 아니라 공명 인수는 3D 활용을 가능하게 하는 소프트웨어와 전체 면역스테인 샘플의 분석 덕분에 처리됩니다.
이러한 소프트웨어를 사용하면 우리가 생성한 거대한 데이터를 빠르게 열어 쉽게 스냅샷과 애니메이션을 만들 수 있습니다. 예를 들어, 샘플을 서로 다른 방향으로 이동할 수 있었고, 예를 들어 X, Y 및 Y, Zed등 다양한 방향으로 2D 슬라이서 도구 덕분에 이미지의 2D 뷰를 생성할 수 있습니다. 또한 이러한 소프트웨어는 중추 및 기본 섬모를 자동으로 감지하여 병리학적 대 제어 조건에서 수를 정량화할 수 있게 합니다.
또한 사이트의 정확한 측정을 위해 기본 섬모의 3D 재구성을 허용합니다. 새로운 피질 발달의 2D iPS 세포 기지를 모델링하기 위해 기술한 프로토콜은 개발 중인 신피질에서 보인 것과 유사한 새로운 피질 전구 및 뉴런을 포함하는 신경 로제트 구조물의 생성을 허용합니다. 상세한 검증은 종래의 면역염색 분석에 의해 수행될 수 있다.
CTIP2 양성 염색에 의해 TBI2 염색 및 초기 뼈 신피성 뉴런에 의해 중간 선조가 드러나는 동안 적용 가능한 선조는 감도에 영향을 미치기 위하여 우리와 함께 이중 염색되어야 합니다. 이러한 신경 로제트 와 같은 구조는 미토틱 스핀들을 유지하는 인양성 핵과 TBX2를 염색하는 인양성에 대하여 제기된 항체와 면역염색에 의해 시각화될 수 있는 급진적인 선조의 상호 키네틱 핵 이동을 모델링합니다. 마지막으로, 섬모발생은 1차 섬모의 후몸을 얼룩지게 하고 공리를 얼룩지게 하는 특정 수단인 pericentric에 대하여 제기된 항체로 면역염색에 의해 분석될 수 있다.
이러한 로제트 구조에서, 정압 폴리 파브리 칼 선조에서 추출된 1차 섬모는 CTIP2 양성 뉴런에서 튀어나온 동안 각 심실류의 중앙 루멘 위에 조밀하게 추출된다. 아데노신경성 로제트의 해리는 1차 실륨 생체 발생 및 기능을 분석하는 데 매우 유용한 고립 된 신경 줄기 및 전구 세포 배양을 생성 할 수 있습니다. 특히, 권장음음약물 또는 삼투압작용제로 치료 후 소닉약물 경로의 유도를 시험하는 절차를 상세히 설명한다.
후속 RTPCR SA는 GLI1 및 PTCH1과 같은 소닉나 약물 표적 유전자의 유도를 테스트하고, 면역 불피성 분석은 오픈 소스 도구, 일라스티크 및 CiliaQ 덕분에 정량화되는 1 차 용실을 따라 주요 음향 약물 성분의 역학을 테스트합니다. 길이 및 방향을 포함한 상이한 섬광 파라미터는 조사되지만, 1차 실륨 성분의 강도는 각각 권장된 소닉나 약물 치료에 대응하여 1차 실슘에서 수용 또는 빠져 나가는 GLI2 및 GPR161을 위해 여기에 나와 있다. 신코르피컬 개발의 3D iPS 세포 기반 모델링을 위해 자세히 설명하는 프로토콜은 기존의 면역 염색 분석 또는 여성 염색에 의해 특징지어질 수 있는 등쪽 전뇌 정체성을 가진 균일한 대뇌 오르간노이드의 생성을 허용하며, 여기에 나타난 바와 같이, 항체의 최적의 침투와 함께 N--cher cadin, PAX6, 및 CTIP2의 염색체 영역, 녹색 및 모든 신생아 신피성 뉴런과 같은 심실 영역에서 분홍색, 정색 선조, 지역과 같은 피질 판에 위치한.
여기에 항체가 다시 제기 된 전체 면역 스테인 오르간노이드의 두 번째 영화입니다, CTIP2, 빨간색으로, 아마도 분홍색으로 유지, 및 TPX2, 녹색, 같은 네오코르테칼 선조의 여러 특성을 테스트 할 수 있도록, 파브리 칼 선조의 중간 키네틱 핵 이동. 흥미롭게도, 인비멘틴 양성 선조는 또한 영역과 같은 상류 영역에서 관찰되며, 외부 방사형 신경교선 선조를 연상시키는 양성 표면으로 확장되는 독특한 양성 공정을 항구하며, 이 방법의 고해상도를 설명한다. 여기에 면역 스테인의 영화입니다, 자유 부동 섹션, 분홍색으로, 공리를 얼룩 진 고 체, 녹색, 그리고 ARLT3B 항체로 검출 된 1 차적인 섬모를 보여주는 공명 스캐닝 현미경 덕분에 취득, 분홍색으로.
1 차 적인 섬모는 모든 신경 줄기및 전구 세포에서 확장, 특히, 서사시 선조의 서사시 표면뿐만 아니라 영역과 같은 전판의 신피성 뉴런에서. 마지막으로 2D 뉴런 로제트와 분리된 줄기 및 전구 세포는 뇌피질 발달의 여러 측면을 재구성하고 수분 생체 발생 및 기능을 테스트하는 보완적이고 유용한 도구를 나타냅니다. 우리가 여기에서 검출하는 프로토콜은 우리가 이 절차의 견고성을 보장하는 균일한 결과를 초래하는 이 명백한 iPS 세포주에서 등쪽 전뇌 오르가노이드를 성공적으로 생성할 수 있었습니다.
전체 오르가노이드 또는 자유 부동 섹션의 면역 스테인링, 지우기 및 이미징을 위해 설정한 프로토콜은 간단하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이러한 세포 기반 모델과 iPS 세포에 대한 3D 이미징 분석을 결합하여, ciliary 변투 세포를 다시 프로그래밍하거나 CRISPR 9 기술을 사용하여 섬모 유전자를 구체적으로 편집함으로써, 대뇌 피질의 정상 및 병리학 적 발달 동안 1 차 실륨의 기여도에 대한 이해에 상당한 진전을 허용해야합니다.
