이 작품은 SSF (B13-0074)와 VINNOVA (2016-04134) 자금 지원 기관에 의해 지원되었습니다.

환자 물질의 수집 및 hiPS 세포의 유도는 2012 년 3 월 28 일 스톡홀름 윤리 검토위원회 (Statics Review Board)에서 승인합니다. 등록 번호 : 2012 / 208-31 / 3. 달리 명시되지 않는 한 세포 배양 단계는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행되어야합니다. 세포 작업시 항상 멸균 취급 기술을 연습하십시오. 시작하기 전에 미디어, 플레이트 및 시약이 실온에 도달하도록하십시오. 고습도에서 37 ° C, 5 % CO 2 에서 세포를 배양하십시오. 1. 피부 생검에서 인간 섬유 아세포의 분리 <ol><li> 배양 배지, 소화 효소, 접시 코팅 및 해부 도구. <ol><li> Fibroblast 배지 준비 : Iscoove 수정 된 둘 베코 배지 (IMDM) 44.5 mL, 태아 소 혈청 (FBS) 5 mL 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEST) 500 μL ( 표 1 참조)를 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 1 mg / mL의 작업 농도에서 소화 효소를 준비하십시오 : wei4ml의 디스 페아 제 및 콜라게나 제 I 형 파우더를 별도의 15-mL 튜브에 분주하고 4 mL의 DMEM / F12 + 1 % PEST에 용해시켰다. 0.22 μm 여과기를 통과시켜 효소 용액을 소독합니다. 매번 신선한 효소 용액을 준비하십시오. </li><li> 인산염 완충 식염수 (DPBS) 0.1 % 젤라틴 1 ML로 해부 당 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35 mm 조직 문화 요리)에 하나 잘 코트. 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 해부를 위해 생검 당 1 세트의 외과 용 가위 및 집게를 고압 멸균합니다. </li></ol></li><li> 생검 처리 참고 : 생검 후 가능한 한 빨리 생체 조직을 처리하십시오. 4 ° C에서 48 시간 동안 PBS + 1 % PEST에 보관하십시오. 생검은 크기가 2 - 4 mm이고 윤리적 허용 기준에 따라야합니다. <ol><li> 35 mm 접시에 생검을 옮깁니다. 생검을 새로운 35 mm 접시로 옮기고 30 초 동안 70 % 에탄올 2 mL에 생검을 잠수시킵니다. </li><li> 생검을 세 번째 위치로 옮깁니다.35 mm 접시와 멸균 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 % 해소 보충 1 ML로 씻으십시오. </li><li> 생검을 네 번째 35 mm 접시에 옮기고 새로 준비한 0.1 % 디스 페스 용액 1 mL를 넣으십시오. </li><li> 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 접시에서 1 - 2 mm 3 조각으로 피부 생검을 잘라 낸 다음 dispase 용액을 포함한 생검 조각을 15 mL 튜브에 옮깁니다. 추가 2 mL의 디스펜서를 첨가한다. </li><li> 35 mm 접시를 1 mL 디스펜스 용액으로 헹구고 15 mL 튜브로 옮긴다. </li><li> 밤새 4 ° C에서 생검을 품어. </li><li> 37 ℃에서 4 시간 동안 튜브에 0.1 % 콜라게나 아제 I 4 mL를 넣고 부화시킨다. </li><li> 3 분 동안 300xg의 소화 세포를 원심 분리하고 상층 액을 흡인하고 섬유 아세포 2mL에 다이제스트를 resuspend. </li><li> 6 잘 조직 문화 플레이트에서 젤라틴 솔루션을 제거합니다. 나머지 조각을 포함하여 세포 현탁액을 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35mm 조직 배양 접시)를 DPBS 중의 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅 하였다. </li><li> 3 일마다 매체를 교체하십시오. </li></ol></li><li> 인간 섬유 아세포의 팽창 참고 : 80 % 합류 ( 그림 2B ) 때 섬유 아 세포는 T25 (25cm 2 ) 조직 배양 플라스크에 passaged 준비가되었습니다. 섬유 아세포는 일반적으로 7 일 이내에 80 %의 confluency에 도달합니다. 그러나 필요한 시간은 크게 다를 수 있지만 4 주를 넘지 않아야합니다. <ol><li> 매체를 기음과 2.5 ML의 DPBS로 한 번 씻으십시오. </li><li> DPBS를 제거하고 Trypsin-EDTA (0.05 %) 1 mL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 둥근 모서리를 표시 할 때까지 배양하여 분리를 시작하십시오. </li><li> 필요한 경우 세포의 적절한 분리를 보장 세포 씻어 섬유 아세포 2 ML을 추가합니다. 3 분 동안 300 XG에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 세포 솔루션을 전송합니다. </li><li> 상청액을 버리고 세포 펠렛을 5 mL의 섬유 아세포 배지 및 플레이트 섬유 아세포에코팅 된 세포 조직 배양 T25 플라스크. 이 단계 후에 섬유 아 세포를 확장하면 위에 설명한대로 해리하고 종자 12 X 10 3 셀 / cm 2 . </li><li> 일단 융합 세포가 냉동 준비가되면 재 프로그램을 위해 팽창 시키거나 플레이트하십시오. 모든 재 프로그램이 시작되기 전에 섬유 아세포의 두 라운드를 동결하십시오 (동결 절차는 다음 섹션 참조). 재 프로그래밍 효율은 일반적으로 낮은 통과 섬유 아세포의 경우보다 높으며, 2-4의 세포가 최적이다. 그러나,이 프로토콜을 사용하여 10 번까지 섬유 아세포의 성공적인 재 프로그램 화가 수행되었다. </li></ol></li><li> 섬유 아세포의 동결 및 해동 <ol><li> 신선한 fibroblast 냉동 매체를 준비하십시오 : 90 % FBS + 10 % dimethylsulfoxide (DMSO). 4 ° C에서 유지하십시오 ( 표 1 ). 일단 합류되면 T25 조직 배양 플라스크를 3 개의 냉동 보관실로 동결시킬 수 있습니다. 냉동 약병 당 섬유 아세포 냉동 매체 500 μL를 준비합니다. </li><li> 세포를 동결시키기 위해 c단계 1.3에서 설명한대로 혈구 계수계를 사용하여 세포 수를 계산하고 3 x 105 세포의 일부를 15 mL 튜브로 옮긴다. 300xg에서 3 분간 튜브를 회전시킵니다. 뜨는을 대기음. </li><li> 4 ˚C의 섬유 아세포 동결 배지 500 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 cryovials로 전송하십시오. 냉동 용기에 유리 병을 넣고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오. </li><li> 세포를 해동 시키려면 37 ° C의 물에 냉동고의 바닥 부분을 담그십시오. 액화되면 세포 현탁액을 15 mL 튜브에 옮기고 5 mL의 섬유 아세포 배지를 첨가하십시오. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀. </li><li> 뜨는을 제거하고 fibroblast 매체 5 ML에서 세포 펠렛을 resuspend. 비 코팅 T25 조직 배양 플라스크에 세포를 옮기고 37 ° C에 품어 라. </li></ol></li></ol> 2. 섬유 아세포의 SeV 벡터 재 프로그램 <ol><li> 벡터 분취 량의 준비 </strong&gt; 주의 : 바이오 안전성 레벨 2의 밀폐하에있는 SeV를 다루십시오. 제조업체의 프로토콜 및 현지 지침 17을 참조하십시오. 바이러스 역가는 배치마다 다릅니다. <ol><li> aliquots을 준비하기 전에 제조 업체의 프로토콜 ( 예 : CytoTune 2.0)에 따라 5 X 10 4 세포에 필요한 벡터의 양을 계산합니다. 바이러스 역가는 일반적으로 8 x 107 ~ 1.5 x 108 입니다. 벡터 5 : 5 : 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 및 hKlf4 = MOI 3) 벡터를 분해하고 결합하십시오. 오토 클레이브 1.5 ML 튜브에 5 X 10 4 세포의 재 프로그램을 위해 계산 된 금액. 재 프로그램을 위해 바이러스 부피를 섬유 아세포 배지로 희석하여 최종 부피 250 μL로 만듭니다. 참고 : 각 유리 병은 5 x 10 4 섬유 아세포가있는 24- 웰 조직 배양 플레이트의 한 개의 웰을 다시 프로그래밍 할 때 유효합니다. 바이러스 분주를 -80 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> SeV 벡터 전달 <ol><li> 흡인 세포 cu배지를 가하고 1 mL의 DPBS로 씻는다. DPBS를 대기음으로하고 트립신 - EDTA (0.05 %) 1 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 인큐베이션한다. </li><li> fibroblast 매체 2 ML을 추가하고 세포를 resuspend하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 3 분 동안 300 XG를 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는을 기음과 fibrosblast 매체 2 ML에 펠렛을 resuspend. </li><li> hemocytometer를 사용하여 섬유 아 세포를 계수하고 24 - 웰 조직 배양 판의 하나의 우물에 5 x 10 4 개의 세포를 시드하십시오. 하룻밤 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 세포 배양 배지를 대기음으로하여 SeV 용액 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오. </li><li> 매일 매체를 신선한 섬유 아세포로 바꿉니다. LN - 521 코팅 플레이트로 passaged하기 전에 transduced 세포가 7 일 동안 성장할 수 있습니다. 통과하기 하루 전 LN-521 판을 준비하십시오. 코팅 절차는 2.3.1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 형질 도입 된 섬유 아세포의 재조합 <ol><li> LN-521 코팅 된 접시 : DPBS에서 LN-521을 최종 농도 0.63 μg / cm 2로 희석하십시오. 60mm 조직 배양 접시 당 LN - 521 솔루션 2 ML 피펫. parafilm을 사용하여 60mm 조직 배양 접시를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. </li><li> 보다 쉬운 취급을위한 Essential 8 medium (E8) 분취 량을 준비하십시오 : E8 배지 48.5 mL, E8 보충액 1 mL 및 PEST 500 μL ( 표 1 ). </li><li> 형질 도입 7 일 후, 세포를 LN-521로 코팅 된 60mm 조직 배양 접시에 옮긴다. Trypsin-EDTA (0.05 %) 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 배양하십시오. 300 x g에서 3 분간 섬유 아세포 배지 2 mL와 원심 분리 세포를 첨가한다. </li><li> 뜨는을 대기음. hemocytometer에서 fibroblast 매체와 카운트 셀 2 ML의 Resuspend 펠렛. 사전 코팅 판에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 LN - 521 precoated 60mm 요리에 섬유 아세포 매체의 5ml에 4 X 10 4 셀을 시드. Rho 키나아제 억제제 Y-27632를 첨가하십시오(ROCKi)를 5 μM의 최종 농도로 첨가 하였다. 37 ° C에서 밤새 품어 둡니다. </li><li> 중요하게, 다음날, 매체를 E8 매체로 변경하십시오. 매일 E8 매체를 교체하십시오. hiPS 세포 콜로니가 2 ~ 3 주 이내에 나옵니다. </li></ol></li></ol> 3. 콜로니 선택 및 hiPS 세포의 확대 참고 : 다음 단계는 스테레오 현미경으로 바이오 안전성 캐비닛 외부에서 수행됩니다. 헤어넷과 절차 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양 물을 오염시키지 않도록 조심스럽게 작업하십시오. <ol><li> 피킹하기 전날 LN-521 코팅 조직 배양 24- 웰 플레이트를 준비하십시오. DPBS 0.63 μg / cm 2 에서 LN-521 희석. 250 - LN - 521 솔루션의 피펫 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 잘. parafilm을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 참고 : 식민지는 직경이 1mm를 초과하면 집어 낼 준비가됩니다. 식민지는 날카로운 모서리를 나타내고 균질 한 mon으로 자라야한다.olayers ( 그림 2D ). </li><li> LN - 521 솔루션을 대기음하고 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 E8 500 μL를 추가합니다. </li><li> stereomicroscope 아래 패턴과 같은 격자에 메스와 작은 조각으로 식민지를 잘라. 기계적으로 접시에서 세포 시트를 긁어 준비 잘 ( 그림 2D -2E ) 200 μL 피펫을 사용하여 시트를 전송할 수 있습니다. 콜로니를 별도의 우물로 선택하십시오. </li><li> 48 시간 동안 배지를 바꾸지 않고 세포가 부착되도록하십시오. 그 후, 매일 E8 배지로 교환하십시오. </li><li> 콜로니의 크기가 5 mm를 초과하면 LN-521 코팅 판의 새 우물에 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과시킵니다. </li><li> 세포에서 세포 배양 매체를 대기음과 DPBS 250 μL로 씻으십시오. </li><li> DPBS를 기음. 해리 시약 250 μL를 추가하고 37에서 3 분 품어 ° C. </li><li> 세포가 반올림되기 시작했는지 관찰하십시오. 떼다세포를 해리 시약으로 몇 번 헹구어 플레이트에서 제거한다. </li><li> 15 ML 튜브에 E8 매체 500 μL를 추가합니다. 해리 시약의 세포를 튜브에 옮기고 300 x g에서 3 분간 원심 분리한다. </li><li> LN - 521 precoated 우물에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 500 μL 실내 온도 E8 매체를 추가합니다. </li><li> 뜨는을 대기음과 E8 매체 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> hemocytometer를 사용하여 세포를 계산하고 준비 LN - 521 precoated 잘 (1.25 X 10 4 - 2.5 X 10 4 셀 / cm 2 )에서 2.5 X 10 4 - 5 X 10 4 세포를 시드. 세포 배양 양식은 의도 한 목적에 맞게 쉽게 확대 할 수 있습니다. </li><li> ROCKi를 10 μM의 최종 농도에 첨가하십시오. 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 매일 E8 매체를 교체하십시오. 세포는 보통 4-6 일 후에 통과 할 준비가됩니다. 상기에서 기술 한 바와 같이 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과 시키며, 약 90 % 융합. 참고 : 재 프로그램 벡터는 hiPS 세포 확장 도중 점진적으로 희석되고 통과 12 후에는 검출되지 않습니다. 공평하게 재 프로그램 된 세포는 일반적으로 6 ~ 10 번 통로에서 증식을 멈추거나 특징적인 다 능성 줄기 세포 형태를 잃습니다 ( 그림 3B ). </li><li> hiPS 세포의 동결 및 해동 <ol><li> 세포를 동결하려면, 위에서 설명한대로 효소로 단일 세포로 세포를 해리하고, hemocytometer에서 세포를 계산하고 E8 매체의 1 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 2.5 X 10 5 세포를 전송합니다. 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하십시오. 뜨는을 대기음. </li><li> 4 μC PSC cryomedium 250 μL에 Resuspend 세포 펠렛과 cryovial로 전송합니다. 냉동 보관 용기에 유리 병을 놓고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오. </li><li> 세포를 녹이기 위해서는 미리 코팅 한 24- 웰 조직 배양의 LN-521 웰을 준비하십시오플레이트를 LN-521 용액을 흡입하고 250 ㎕의 E8 배지를 첨가함으로써 배양 하였다. 작은 고드름이 남아있을 때까지 37 ° C의 물에서 냉동 보관함의 바닥 부분을 잠급니다. </li><li> cryovial에 E8 매체 250 μL를 추가하고 세포 현탁액을 15 ML 튜브에 전송하고 E8 매체 1 ML을 추가합니다. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀. </li><li> 뜨는을 제거하고 상온 E8 매체 250 μL의 세포 펠렛을 resuspend. 준비된 우물에 세포 현탁액을 전송하고 1 % 세포 생존 보충 또는 10 μm의 록키를 추가합니다. 37에서 조직 문화 플레이트를 품어 ° C. </li></ol></li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell+culture:+considerations+for+maintenance,+expansion,+and+therapeutics.">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).</li><li>Jacobs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Density+Culture+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Results+in+DNA+Damage+and+Genome+Instability.">Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>. Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf</a> (2016)</li><li>Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+negative+effect+of+donor+age+and+time+in+culture+on+the+reprogramming+efficiency+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).</li></ol>

저자는보고 할 이해 관계가 없습니다.

이 프로토콜의 예상 결과는 여러 clonally derived hiPS 세포 라인의 성공적인 생성입니다. 중요하게, 여기에 기술 된 확립 된 hiPS 세포의 유지 및 확대를위한 방법은 신뢰성이 있고 줄기 세포 배양의 경험이 거의없이 수행 될 수있다. LN-521 매트릭스와 함께 ROCKi와 함께 효소 단클론 항체는 식민지 기반의 구강이 10 , 19 , 20을 자극 할 ?...

다카하시 (Takahashi) 등에 의한 hiPS 세포주의 일차 유도 이후, 1 , 2 , hiPS 세포는 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학 3 에서 세포 치료법을 생성하기위한 원료 물질로서 유용한 도구를 제공합니다. hiPS 세포 배양은 오랫동안 섬유 모세포 피더 세포 4 , 5 또는 Matrigel 6 및 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 배합물과 함께 공 배양에 의존 해왔다. 일괄 배치 (batch-to-batch) 편차는 이러한 배양 조건의 정의되지 않은 특성의 공통적 인 결과이며 예측할 수없는 변형을 가져 오며 이는 이러한 프로토콜의 신뢰성을 저해하는 주요 원인입니다. Essential 8 (E8) 8 및 정의 된 세포 배양 기질, 예를 들어 LN-521 9 와 같은 한정 배지의 개발은재현성있는 프로토콜을 확립하고 homogenous hiPS cell 7 , 8 , 9 , 10 의 강력한 생성 및 유지를 돕습니다. 통합 자유 재 프로그래밍 기술의 개발은 도약을 가져 왔습니다. 원래 재 프로그램은 레트로 바이러스 벡터에 의존하여 무작위로 게놈에 통합되어 게놈 무결성에 파괴적인 영향을 미쳤습니다. 리 프로그래밍 방법의 발전에는 RNA 기반 벡터의 개발이 포함됩니다. RNA 벡터는 게놈 재조합을 통한 의도하지 않은 통합이 가능하지 않기 때문에 DNA 기반 재 프로그램 방법보다 이점이 있습니다 12 . SeV 벡터는 DNA- 상 11 없이 단일 가닥 RNA를 통해 외인성 인자를 과도하게 높게 발현한다. SeV에 의해 전달 된 재 프로그래밍 벡터세포 배양 전반에 걸쳐 희석되고 궁극적으로 배양 물로부터 흘려 발판 인쇄 방법으로 재 프로그램 할 수 있습니다. 그 후, pluripotency의 유지는 pluripotency 유전자 2 의 내인성 발현에 의존합니다. 선구적인 hiPS 세포 기반 치료법이 임상 시험으로 옮기기 시작함에 따라 표준화 된 배치, 재현성 및 안전성에 대한 요구가 13을 해결하는 데 필수적인 문제입니다. 그러므로 동물 기원의 제품은 피해야한다. 예를 들어, 이종 생산물의 사용은 비인간 병원균 오염의 위험과 관련되어있다. 또한, 동물 유래 배양 성분의 존재 하에서 배양 된 세포는 비인간 실리아 산을 세포막 내로 도입시켜 유도 된 세포를 면역 원성으로 만드는 위험이있다. 따라서 이종 제품을 제거해야 할 필요성은 앞으로의 임상 적 진료에 필수적입니다. 이 프로토콜은 xe를 적용합니다.세포를 임상 순응에 더 가깝게 이동시키는 hiPS 세포의 유지에 자유롭고 정의 된 배양. 이 프로토콜은 섬유 아세포에서 표준화 된 hiPS 세포를 생성하는 일관되고 재현성 있고 사용하기 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 기존의 hiPS 세포를 유지 관리 할 수있는 친숙한 배양 시스템을 제공합니다. 이 프로토콜은 Karolinska Institutet의 스웨덴 국가 인체 iPS 코어 시설에서 300 줄 이상의 hiPS 세포주를 추출하는데 사용되어 왔으며이 중 일부 줄은 이미 15 , 16 에 기술되어있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="711">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dispase</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">171105-041</td>
			<td style="width:223px;">Biopsy digestion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>Biopsy digestion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Fibroblast matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IMDM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21980002-032</td>
			<td>Fibroblast medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Fibroblast medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PenicillinStreptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 8 media</td>
			<td>ThermFisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>iPS cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-03</td>
			<td>iPS cell culture matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypLE select 1X</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rho-kinase inhibitor Y27632</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>Rho-kinase inhibitor (ROCKi)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CytoTune &#8211; iPS 2.0 reprogramming kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1377801</td>
			<td>Sendai virus reprogramming vector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901.300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 well tissue culture plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922.300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T25 tissue culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2311</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030123.301</td>
			<td>1.5 ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolCell cell LX</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>BCS-405</td>
			<td>Freezing container</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td>Fibroblast freezing</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Cryovials 1.8 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>479-6847</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PSC Cryopreservation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2644601</td>
			<td>PSC CryomediumRevitaCell supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Fibroblast dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>Digestive enzymes dilutant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>ThermoFIsher Scientific</td>
			<td>14025-050</td>
			<td>Biopsy preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">BRAND, 718920</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integration free derivation of human induced pluripotent stem cells using laminin 521 matrix

Xeno-free 및 완전 정의 된 조건은 균질 한 사람 유도 pluripotent stem (hiPS) 세포의 강력하고 재현성있는 생성을위한 핵심 매개 변수입니다. 피더 세포 또는 정의되지 않은 매트릭스상의 hiPS 세포의 유지는 배치 차이, 병원성 오염 및 면역 원성의 위험에 취약하다. 제노 프리 및 정의 된 배지 배합물과 조합하여 정의 된 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스를 사용하면 변이가 감소하고 hiPS 세포의 일관된 생성이 가능해진다. 센다이 바이러스 (SeV) 벡터는 비 통합 RNA 기반 시스템이므로 벡터 통합 벡터가 가질 수있는 게놈 무결성에 대한 파괴적인 효과와 관련된 우려를 회피 할 수 있습니다. 또한, 이들 벡터는 진피 섬유 아세포의 재 프로그래밍에서 비교적 높은 효율을 입증 하였다. 또한, 세포의 효소 단일 세포 passaging은 줄기 세포의 실질적인 사전 경험없이 hiPS 세포의 균질 유지를 용이하게합니다문화. 여기서는 재현성과 사용 용이성에 중점을두고 광범위하게 시험하고 개발 한 프로토콜을 기술하여 섬유 아세포에서 정의되고 이종없는 인간 hiPS 세포를 생성하는 강력하고 실질적인 방법을 제공합니다.

생검에서 hiPS 세포로 생체 검사부터 확립 된 hiPS 세포에 이르는 전체 과정은 재 프로그램 벡터가 없으며 특성화를 위해 준비되며 약 16 주 소요됩니다 ( 그림 1 ). 보다 자세한 타임 라인은 그림 2A에 명시되어 있습니다. 섬유 아세포 배양을 확립하고 확장시키기 위해서는 약 4 주가 소?...

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Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

integration-free-derivation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K 조회수.  Karolinska Institutet.  인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다. 

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Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

연구

발생학

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.