성상 세포의 3D 생체 인쇄는 신경 조직 공학의 진보를 나타내며, 신경 질환과 관련된 메커니즘을 이해하는 데 유용한 체외 모델의 생체 제작을 허용합니다. 3D 바이오프린팅의 주요 장점은 조직의 생화학적 및 기계적 특징을 모방한 세포 외래 구조를 바이오패브릭화하여 건강과 질병의 세포 역학에 대한 이해를 높이는 것입니다. 이 프로토콜은 천연 폴리머 및 세포외 매트릭스 구성 요소로 구성된 바이오 잉크의 3D 바이오 프린팅을 기반으로 다른 연조직의 생체 제작에 적용될 수 있다.
우선 안락사 된 마우스에서 분리 된 피질 조직을 곡선 된 마이크로 가위로 작은 조각으로 자른다. 위아래로 파이프를 통해 HBSS의 1 밀리리터로 티슈 조각을 세 번 씻으라. 세 번째로 추가 된 HBSS를 제거 한 후, 0.05 %의 1 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 조직을 배양하십시오.
기계적 조직 해리의 경우 조직 트립신 혼합물을 15번 위아래로 부드럽게 피펫합니다. 다음으로, 해리된 혼합물을 15밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 동일한 양의 FBS를 추가하여 트립신 활성을 중화시합니다. 0.4 마이크로미터 셀 스트레이너 필터를 통해 서스펜션을 필터링하여 분리되지 않은 조각을 제거합니다.
성상 세포 배지의 1 밀리 리터로 필터를 세척하십시오. 원심분리에 의해 여과된 세포 현탁액을 펠릿다운한다. 상체를 폐기한 후, 성상세포 배양 배지의 1밀리리터에서 세포 펠릿을 중단한다.
세포 현탁액을 T25 배양 플라스크로 전송합니다. 총 중간 크기 3.5 밀리리터를 구성하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 밀리리터당 3밀리그램의 최종 농도에서 피브리노겐을 얻기 위해 밀리리터 피브리노겐 용액당 0.9 밀리리터를 젤라틴-젤라틴 메타크릴 용액으로 옮길 수 있습니다.
최종 농도0.5%의 부피중량에서 사진 시인을 획득하려면, 준비된 젤라틴-젤라틴 메타크라이로일 피브리노겐 용액에 0.015 그램의 사진 시인을 추가한다. 소용돌이 를 피한 후, PI 저하를 방지하기 위해 빛으로부터 보호, 섭씨 40도에서 솔루션을 유지합니다. 다음으로 0.2 마이크로미터 필터를 통해 용액을 멸균 15 밀리리터 원내 튜브로 필터링합니다.
생체 재료 용액의 980 마이크로리터를 15 밀리리터 원내 튜브로 이송합니다. 밀리리터 당 2 마이크로그램의 최종 농도에서 라미닌을 얻기 위해, 바이오 잉크를 함유 한 튜브에 희석 된 라미닌 20 마이크로 리터를 추가합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 부드럽게 섞어 거품을 피하고 세포와 섞을 준비가 될 때까지 바이오 잉크 용액을 섭씨 37도에서 유지합니다.
5 분 동안 0.05 %의 트립신으로 기본 성상 세포를 시도하고 1 대 1의 비율로 FPS로 트립신 활동을 중화시합니다. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 원물 튜브 및 원심분리기로 5분 동안 200배 G로 이송합니다. 세포를 계산한 후, 입증된 바와 같이 6세포에서 6세포로 1회 10을 이송한다.
튜브에 상체의 200 마이크로 리터만 두고 원적 튜브의 바닥을 부드럽게 눌러 세포 펠릿을 중단하십시오. 밀리리터당 6개의 세포에 1회 10의 최종 농도를 얻으려면, 젤라틴-젤라틴 메타크라이로일 피브리노겐 용액의 1밀리리터를 세포를 포함하는 튜브로 옮기고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 균질화한다. 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 젤라틴-젤라틴 메타크라이로일 피브리노겐 바이오 잉크 용액에 배치된 성상세포를 5밀리리터 플라스틱 주사기로 천천히 전달하여 거품 형성을 피하십시오.
멸균 22 게이지 무딘 바늘을 주사기에 연결합니다. 바이오 프린터를 15분 동안 UV 광에 노출한 다음 바이오 프린터를 70%에탄올로 닦은 다음 주사기를 바이오 프린터 인쇄 헤드에 연결하고 바이오 잉크를 수동으로 플러시하여 남은 거품을 제거합니다. 바이오 프린팅을 수행하기 위해, 바이오 프린터 테이블에 35 밀리미터 배양 접시에 배치, 바늘을 배치 0.1 밀리미터 멀리 배양 접시 표면에서 바늘을 배치하고 인쇄 "버튼을 누릅니다.
바이오 프린팅이 끝나면 주사기가 접시에서 벗어나 문화 요리를 닫아야 합니다. 젤라틴 메타크라이로일 크로스 링크용 UV 빛 아래에 문화 접시를 놓습니다. 멸균 주걱을 사용하여 생체 인쇄 구조를 24 웰 플레이트로 옮기.
500 마이크로리터의 혈소판 염화물 용액을 추가하고 30분 동안 방치하여 피브린의 교차 연결을 허용합니다. 교차 연결 용액을 제거 한 후, PBS의 두 밀리리터로 구조를 세척 한 다음 성상 세포 배양 배지의 1 밀리리터로 PBS를 교체하십시오. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양하고 3일마다 배지를 바꿉니다.
주걱을 사용하여 생체 인쇄 구조를 35mm 배양 접시로 옮기하십시오. PBS의 1 밀리리터로 구조를 세척합니다. 살아있는 죽은 시약의 100 마이크로 리터를 구성 위에 입금하고 30 분 동안 섭씨 37도에서 유지하여 빛으로부터 보호하십시오.
살아있는 죽은 시약을 제거 한 후, 입증 된 대로 PBS로 구조를 씻어. 시료를 공초점 접시로 옮기고 이미지 획득을 위해 488 및 570 나노미터 의 여기를 사용하여 공초점 현미경하에서 구체 내의 세포를 관찰한다. 3D 바이오프린팅 후, 생체 인쇄 스캐폴드의 무결성을 추정하고 생체 재료 내에 포획된 세포로 잘 정의된 구조의 형성을 관찰하였다.
바이오 프린팅 및 교차 연결 과정 후, 대부분의 세포는 구조가 성상세포 배지로 배양되었을 때 둥근 형태를 제시했습니다. 생체 인쇄 된 스캐폴드는 7 일 간의 배양 후 무결성을 유지했으며 일부 둥근 세포가 관찰되었지만 많은 성상 세포가 구조 전체에 퍼져 성상 세포 형태와 상호 연결을 제시합니다. 세포 생존력은 생체 인쇄 직후 평가되었고, 결과는 더 낮은 속도로 실행 가능한 세포가 전체 세포의 최대 74%를 나타내며, 더 높은 속도로 생체 인쇄된 세포보다 훨씬 높은 것으로 나타났습니다.
생체 인쇄 성상세포의 생존가능성은 2D 배양 성상세포로 정상화되었고, 그 결과는 7일째에 생체 인쇄성 성상세포가 생존가능성을 크게 증가시켰다는 것을 나타냈다. 생체 인쇄 직후, 성상 세포는 둥근 형태를 보여주고 죽은 분석체를 살아. 1 주일 후, 성상 세포는 구조 전체에 확산 및 세포의 뚜렷한 형태를 제시, 2D 배양과 동일.
3D 생체 인쇄 성상 세포는 면역 형광을 특징으로했다. 생체 인쇄 구조에서 7 일 간의 배양 후 별모양의 형태를 가진 고밀도 성상세포가 관찰되었습니다. 생체 인쇄 성상세포 세포는 특정 성상세포 마커 신경교 섬유산성 단백질을 발현하여 7일간의 생체 인쇄 후 성상세포 표현형의 유지를 나타내며, 이러한 결과는 바이오 잉크 조성이 성상세포의 접착력, 확산 및 성장을 촉진하기 위한 생체 적합성 마이크로환경을 제공했음을 나타낸다.
생체 인쇄 성상세포에 의한 특정 유전자 및 세포 마커 발현의 평가는 특정 자극 에 따른 성상세포 반응성, 신경 조직 과 같은 기능의 증거를 제공할 것이다. 이 프로토콜은 생체 분자에 있는 세포의 다른 모형으로 구성된 더 복잡한 신경 같이 구조물의 biofabrication를 위한 도로를 포장합니다, 특정 신경생성 틈새 의 모방을 허용하.
