TR-FRET 기반 분석은 JAK/STAT 신호전달 경로의 특정 및 선택적 조절제의 스크리닝 및 약리학적 특성화를 위한 새로운 비용 효율적인 도구를 제공합니다. 이 기술은 웨스턴 블롯 및 ELISA와 같은 기존의 방법보다 훨씬 쉽고 빠르며 재현 가능하며 강력합니다. 세척 단계가 필요하지 않으며 시약이 단일 단계로 첨가됩니다.
이러한 면역검정 플랫폼은 특정 항체가 이용가능한 제공된 다른 세포 신호전달 단백질에 용이하게 적용될 수 있다. 재현 가능한 검정을 설계하려면 좋은 세포 배양 방법을 사용하고 표준 운영 절차를 수립해야 합니다. 또한 세포 배양 및 치료 조건을 신중하게 최적화해야합니다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 과학자 인 Genevieve Chatel이 될 것입니다. 시작하기 위해, HeLa 및 A431 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 배양기에서 10%FBS로 보충된 DMEM을 사용하여 배양한다. 세포가 70 ~ 80 %의 합류에 도달하면 트립신을 시도하고 통과하거나 분석에 사용하십시오.
분석을 수행하기 위해, 미리 최적화된 밀도에서 50 마이크로리터의 세포를 적절한 배양 배지의 96-웰 조직 배양 처리 플레이트에 분주한 다음, 이들을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 배양기에서 밤새 배양한다. 다음날, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트의 12 웰에 걸쳐 무혈청 매질에서 화합물을 연속적으로 희석함으로써 시험 화합물의 중간체 2배 및 4배 희석 시리즈를 제조하였다. 세포 자극을 위해, 시뮬레이터를 포함하는 50 마이크로리터의 무혈청 배지를 2X 농도로 첨가하고, 실온 또는 37도에서 미리 최적화된 시간 동안 세포를 인큐베이션한다.
세포 억제를 위해, 억제제를 함유하는 25 마이크로리터의 무혈청 배지를 4X 농도로 첨가하고, 실온 또는 37도에서 미리 최적화된 시간 동안 세포를 인큐베이션한 다음, 자극기를 포함하는 무혈청 배지 25 마이크로리터를 4X 농도로 첨가하고, 사전 최적화된 시간 동안 인큐베이션한다. 다음으로, 세포를 용해시키기 위해, 보충된 1X 용해 완충액을 준비하고 그것에 포스파타제 억제제 칵테일을 첨가한다. 세포 배양 배지를 조심스럽게 제거 및 폐기한 후, 즉시 준비된 1X 보충 용해 완충액 50 마이크로리터를 첨가하고, 적당한 교반으로 진탕 하에 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
TR-FRET 검출을 위해, 1X 검출 완충액에서 4X 항체 검출 믹스를 준비한 다음, 1X 검출 완충액에서 EUAB1 및 FRAB2 항체 용액뿐만 아니라 EUAB3 및 FRAB4 항체 용액을 준비한다. 마지막으로, 포스포단백질의 검출을 위해 미리 희석된 EUAB1을 미리 희석된 FRAB2와 혼합하고, 총 단백질의 검출을 위해 미리 희석된 EUAB3 및 미리 희석된 FRAB4를 혼합한다. 그 다음 96-웰 배양 플레이트로부터 세포 용해물의 15 마이크로리터를 백색 저용량 384-웰 마이크로플레이트의 웰로 조심스럽게 피펫팅한다.
다음으로, 15 마이크로리터의 양성 대조군 용해물 및 15 마이크로리터의 1X 용해 완충액을 음성 대조군으로서 첨가하여 분석 웰을 분리한다. 용해물의 15 마이크로리터를 함유하는 웰에, 상응하는 4X 항체 검출 믹스의 5 마이크로리터를 첨가하여 포스포단백질 또는 총 단백질을 검출한다. 플레이트를 플레이트 실러로 덮은 후, 분석 키트에 따라 한 시간 내지 하룻밤 동안 실온에서 인큐베이션한다.
인큐베이션이 완료된 후, 접착 플레이트 실러를 제거하고 TR-FRET 호환 마이크로플레이트 리더 상에서 플레이트를 판독하였다. A431 세포에서 총 STAT5와 함께 U266B1 세포에서 총 STAT1 및 포스포-STAT4를 갖는 포스포-STAT1의 검출 및 정량화를 위한 TR-FRET 분석의 결과는 농도 반응 곡선을 사용하여 나타내었다. 유사하게, HeLa 세포에서 포스포-STAT3 및 총 STAT3 및 포스포-STAT6 및 총 STAT6의 검출 및 정량화를 위한 TR-FRET 검정은 농도 반응 곡선을 사용하여 표시된다.
전반적으로, 모든 분석은 견고한 TR-FRET 신호, 넓은 동적 범위, 낮은 웰 간 계수 변동 및 허용 가능한 신호 대 배경 비율을 보여주었습니다. JAK 활성화제, 인터페론 alfa-2B 및 IL-4 및 EGF로 세포를 처리한 결과, 특정 티로신 잔기에서 STAT 인산화의 예상 농도 의존적 증가를 보인 반면, 상응하는 총 STAT 단백질은 안정적으로 유지되었다. JAK 억제제 및 에를로티닙 둘 다 상응하는 포스포-STAT 수준을 농도 의존적 방식으로 억제하였다.
서스펜션 세포주에서 인터페론 알파-2B에 의한 포스포-STAT4 자극 또는 원플레이트 프로토콜을 사용하는 부착 세포주에서 IL-4에 의한 포스포-STAT6 자극의 결과는 2-플레이트 프로토콜을 사용하여 수득된 것과 일치하였으며, 따라서 원플레이트 올인원 웰 프로토콜에 대한 2-플레이트 전달 프로토콜의 성공적인 적응성을 보여주었다. 현탁 세포주를 이용한 포스포-STAT1 검정 및 부착성 세포주를 이용한 포스포-STAT3 검정에 대한 플레이트내 가변성 연구의 결과는 HTS 적용을 위한 이들 포스포-STAT 분석의 견고성을 입증한다. 전체 세포 추출물에 존재하는 활성 포스파타제로부터 인산화된 단백질의 탈인산화를 방지하기 위해 포스파타제 억제제 칵테일로 용해 완충액을 보충하는 것이 필수적이다.
