우리는 리간드 결합 부위의 확인 및 특성화, 서브유닛 배향, 리간드 결합과 관련된 형태적 변화, 단백질의 동적 운동을 허용하는 FRET 매핑 방법론을 개발했습니다. 이 기술의 장점은 용액에서 수행 할 수 있고 분자가 자유롭게 움직일 수 있다는 것입니다. 이 기술로 측정 된 거리는 생물학적 시스템에 적합합니다.
FRET는 많은 시스템에 광범위하게 적용됩니다. 매핑은 모든 생체 분자 시스템의 구조적 및 동적 변화에 대한 모니터링을 향상 시키며 입체 구조 정보가 존재하는 경우 특히 효과적입니다. 단백질을 정제 한 후, 가장 어려운 부분은 고효율로 라벨링하고 자유 염료를 제거하는 것입니다.
실험을 위해, 가능한 한 적은 자유 염료를 갖는 것이 도움이됩니다. 시작하려면 징벌적 결합 부위의 25 ~ 75 옹스트롬 이내와 단백질의 비교적 정적 인 영역에서 표지 부위를 선택하십시오. 거리는 사용될 특정 FRET 염료 쌍을 결정할 것이다.
서로 비교적 구별되는 단백질 영역에서 표지 부위를 찾습니다. 따라서 사이트는 삼각형의 꼭짓점을 설명하며 징벌적 바인딩 사이트는 중앙에 있습니다. 원하는 큐벳 크기와 부피에 따라 R0 값을 측정하려면 전체 단백질의 동일한 농도에서 두 개의 단백질 샘플을 준비하십시오.
하나는 공여체 염료로만 표지된 단백질로, 다른 하나는 수용체 염료로만 표지된 단백질이다. 분광계를 사용하는 경우 형광계를 켜고 FluorEssence 소프트웨어에서 스펙트럼 수집 및 분석 프로그램을 엽니다. 빨간색 M을 클릭하여 컴퓨터를 계측기에 연결하고 방출 스펙트럼을 선택합니다.
여기 파장, 방출 스캔 범위, 온도 및 샘플 위치 변경과 같은 실험 메뉴 항목을 사용하여 스캔 매개 변수를 입력합니다. RTC를 클릭하고 원고에 설명된 대로 최적화된 기기 설정을 클릭하고, 염료의 흡수 최대치에 설정된 여기 파장을 사용하여 피크에서의 형광 방출을 모니터링합니다. 공여체 표지된 단백질 샘플을 샘플 홀더에 넣고, 클릭 실행을 실행하여 공여체 염료만으로 표지된 단백질의 방출 스캔을 생성하고, 샘플을 염료 흡수 최대치에서 흥분시켜, 방출 피크 위로 주사한다.
피크의 끝을 지나서 25 내지 50 나노미터에서 스캔을 연장함으로써 스캔에 대한 기준선을 확립한다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이, 상이한 농도의 샘플에 대한 흡수 및 형광 측정을 수행하여 공여체 단백질만의 양자 수율을 측정한다. 공여체 단백질, 수용체 전용 단백질 및 공여체 수용체 단백질 샘플을 동일한 농도로 준비하십시오.
형광 방출 스펙트럼을 생성하기 위해 주사된 공여체만을 얻는다. 용액을 공여체 염료 흡수 최대치에서 여기시키고, 공여체 및 수용체 방출 피크를 통해 스캔한다. 샘플을 수용체 전용 단백질로 교환하거나 샘플을 변경하여 수용체 전용 단백질을 포함하는 큐벳으로 위치를 변경하십시오.
수용체 염료만으로 표지된 단백질의 방출 주사를 얻는다. 기증자 여기 파장에서 샘플을 흥분시킨다. 샘플을 공여체-수용체 단백질 샘플로 교환하거나 샘플을 변경하여 공여체-수용체 표지된 단백질을 함유하는 큐벳으로 위치를 변경한다.
동일한 설정을 사용하여 공여체-수용체 단백질 샘플의 방출 스캔을 얻는다. 모든 스펙트럼에 대해, 스캔이 끝날 때 측정된 배경 카운트를 빼서 배경 형광을 보정하십시오. PyMOL과 같은 3D 그래픽 보기 프로그램을 사용하여 스크립트의 명령을 적절한 거리 정보와 함께 명령 창에 직접 입력하여 거리를 구조에 매핑합니다.
측정된 각 거리 및 관련 오류에 대한 셸을 생성합니다. 다른 쉘의 교차점을 통해 위치를 매핑합니다. 신호 펩티드 결합 부위는 SecA 및 SecYEG 상의 세 개의 상이한 위치, 및 신호 펩티드 상의 네 개의 상이한 위치를 사용하여 맵핑되었다.
FRET 실험은 예비단백질의 상이한 영역과 SecA 및 SecYEG 단백질 상의 세 개의 별개의 위치 사이의 예비-단백질 결합 부위 및 배향을 지도화한다. 신호 펩티드의 징벌적 결합 부위는 이전에 두 나선 손가락으로 확인되었고, SecA C 말단 꼬리는 두 나선 손가락에 평행한 배향을 제안했다. SecA37, 및 PhoA2, 및 PhoA22 사이의 정상 상태 FRET 스펙트럼이 얻어졌다.
공여체 강도의 감소는 PhoA22로부터 더 큰 에너지가 전달된다는 것을 나타내었다. SecA37에서 더 멀리 떨어진 곳에 위치한 PhoA2 사이트에 상대적입니다. 시간 분해된 형광 붕괴 스펙트럼은 공여체-수용체 복합체가 한 거리와 관련된 에너지 전달과 일치하는 더 짧은 균질 붕괴를 갖는다는 것을 입증하였다.
SecA PhoA2 잔기와 삼각측정 부위 사이에 구축된 FRET 거리 쉘은 각 쉘이 녹색으로 표시된 가정된 결합 부위인 2나선 손가락과 교차한다는 것을 입증하였다. 교차된 영역은 각각의 FRET 쉘보다 작고, 나선형 스캐폴드로부터의 큰 기여를 포함한다. PhoA2 잔기와 표지된 부위 사이에서 결정된 FRET 거리 쉘은, SecYEG 채널의 2나선 손가락 및 입의 팁에 더 가깝게 위치하는 더 작은 영역을 기술한다.
이 교차 영역은 PhoA2의 2 나선 손가락의 반대쪽 끝에 있습니다. 고려해야 할 중요한 사항에는 관심 영역을 삼각 측량하고, 각 부위에 대한 양자 수율을 측정하고, 모든 자유 염료를 제거하기 위해 표지 부위를 적절하게 선택하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 NMR 또는 X선 결정학과 같은 방법으로 얻은 구조 정보와 일치합니다.
FRET 결과가 구조적 맥락에 투입되면 기존 정보를 향상시킬 수 있다.
