지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

여기에서 우리는 만능 중간엽 세포의 주입과 같은 치료 단계의 사용을 위해 양호하고 생존 가능한 세포를 얻고 보존하기 위한 프로토콜을 시연했습니다. 이것의 주요 이점은이 기술을 사용하여 수집 된 조직으로부터 세포의 분리 단계에서 얻은 시간 대비 생존 가능한 세포 부피를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 이형 의학 및 세포 요법이 적용되는 모든 질병 또는 상태로 확장 될 수 있습니다.

이 방법은 장기 세포 배양이 장려 될 수있는 약물 검사와 같은 영역에서 세포 게놈 안정성 검사에도 적용될 수 있습니다. 살아있는 세포를 조작 할 때마다 침착하고 자신감을 가지십시오. 패혈증에 극도의 주의를 기울이고 역경을 관찰하고 올바른 결정을 내리기 위해 과학자의 눈으로 끊임없이 경계하십시오.

가방의 무게를 측정하고 디지털 비접촉 적외선 임상 온도계로 온도를 측정하는 것으로 시작하십시오. 층류 챔버 내부에 5 분 동안 백을 두어 기름기 층을 침전시키고 세포가 들어있는 조직을 분리합니다. 칼슘이 든 DPBS 100ml를 이송 백에 넣고 손으로 섞습니다.

5 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 백 어댑터에 부착 된 60 밀리리터 주사기를 사용하여 침전되는 대부분의 기본 액체를 버립니다. 이 과정을 두 번 반복하십시오.

소화 용액 100 밀리리터를 백에 넣고 천천히 저어 주면서 섭씨 37도에서 30 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 가방의 모든 내용물을 4 개의 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 섭씨 22도에서 10 분 동안 400G에서 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 20% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM 저혈당 5밀리리터를 세포 펠릿에 추가합니다.

증류수에 0.05 % 10 마이크로 리터의 트리판 블루의 신선한 용액을 10 마이크로 리터의 세포 현탁액과 5 분 동안 혼합합니다. 20X 배율의 도립 광학 현미경을 사용하고 Neubauer 세포 계수 챔버에서 생존 가능한 세포를 계수합니다. 세포 펠릿을 밀리리터당 100만 세포 농도의 냉동 보호 배지에 현탁합니다.

그런 다음이 혼합물 1 밀리리터를 냉동 바이알에 넣으십시오. 분당 섭씨 1 도의 냉각 속도로 냉동 용기를 사용하고 섭씨 80도에서 1 년 동안 보관하십시오. 1 년 후 액체 질소 증기상에 담근 표준 카세트 상자에 보관하십시오.

9 명의 환자로부터의 절차의 다른 단계의 데이터가이 표에 제시되어있다. 초기 세포 수율에 따라, 각 샘플에 대한 세포의 가변 부피가 결정되었다. 세포 수율이 높은 샘플 1 밀리리터, 중간 세포 수율을 가진 샘플의 경우 1.1 밀리리터, 세포 수율이 낮은 샘플 당 2 밀리리터.

통과 전의 세포 수율은 트립신화 전에 동일한 합류가 관찰된 경우에도 광범위하게 다양했습니다. 따라서 여기서 세포는 층으로 성장했을 수 있습니다. 대표 이미지는 광학 현미경에서 분리 후 첫 번째 통로에서 플라스틱 부착 중간엽 ADSC를 보여줍니다.

세포는 플라스틱 및 섬유 아세포와 같은 형태에 대한 접착력을 보여줍니다. 트리판 블루 분석에서 Neubauer 챔버에서 계수된 생존 세포가 여기에 표시됩니다. 6 명의 환자로부터의 유세포 분석 데이터가이 표에 제시되어있다.

이들 CD45 음성 세포로부터, 줄기 세포 마커의 상이한 조합을 갖는 ADSC의 백분율이 결정되었다. 대표적인 이미지는 8개월간의 냉동 보존 후 사례 9의 SVF에서 줄기 세포 관련 마커에 대해 양성인 세포의 하위 집단을 보여줍니다. 여기서, R1은 순방향 산란 대 측면 산점도에서 분석된 전체 세포 영역이다.

R2는 CD45 음성 영역이다. CD73, CD90 및 CD105 인구는 이 지역에서 양성입니다. 연골 세포, 골 세포 및 지방 세포에서의 ADSC 분화가 여기에 표시됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 천천히, 가급적이면 손으로 저어주고 섭씨 37도에서 30분 동안 방치하여 유착과 물집을 관찰하는 것을 잊지 마십시오. 작업실 온도를 섭씨 25도 정도로 유지하고 훨씬 더 큰 온도에서 열 충격을 피하십시오. 여기에 표시된 기술은 만능 중간엽 세포를 다른 조직에서 성공적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다.