신경 퇴행성 및 행동 연구에서 강력한 동물 모델 인 C.elegans는 헌팅턴병 유사 모델을 사용하여 폴리 글루타민 신경 독성에 대한 독성 화합물을 효율적으로 스크리닝하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 C.elegans 모델에서 여러 표현형을 프로파일 링하고 통합하는 것입니다. 또한 실제로 C.elegans 모델이이 방법에 사용됩니다.
그것은 다른 신경 퇴행성 지연 및 실제로 다른 지연에 대한 치료 후보의 스크리닝 및 조사에 크기를 제공합니다. C.elegans 성장에 사용되는 온도에주의를 기울이고 이름 발달의 올바른 단계에서 테스트를 수행하십시오. 절차를 시연하는 것은 Jiang Yiyi, Xioa Yue, Wang Qiangqiang, 3 명의 대학원생이 될 것입니다.
AM141 선충류의 300-500 개의 동기화 된 L1 유충을 E.coli의 OP50 균주와 황기 밀리리터 당 5 밀리그램을 포함하는 500 마이크로 리터의 S 배지가있는 48 웰 플레이트의 각 웰로 옮기는 것으로 시작하십시오. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 섭씨 20도에서 원하는 시간 간격으로 분당 120회 회전하여 배양합니다. 선충류를 멸균 된 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 옮기고 원심 분리로 M9 완충액으로 3 회 세척하여 나머지 OP50 세포를 제거했습니다.
그런 다음 M9 버퍼에서 AM141 선충을 다시 일시 중단합니다. 이제 10-15 개의 선충류를 384 웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 각 처리에 대해 10 개의 복제 웰을 설정하고 각 웰에 10 마이크로 리터의 200 밀리몰 나트륨 아 지드화물을 추가하여 선충류가 바닥에 정착되도록하여 마비시킵니다. 형광 이미지를 획득하기 위해 고함량 이미징 시스템에 플레이트를 놓습니다.
이미지 수집 소프트웨어를 열고 텍스트 원고에 언급된 파라미터를 설정합니다. 검토 플레이트 데이터 창을 열고 이미지 분석을 위한 테스트 플레이트를 선택하여 이미지 데이터를 분석합니다. 테스트 웰을 두 번 클릭하여 이미지를 표시합니다.
그런 다음 분석 방법으로 카운트 핵을 선택하고 설정 구성 버튼을 클릭합니다. FITC 채널에서 소스 이미지를 정의하고 표준 알고리즘을 선택합니다. 텍스트 원고에 설명 된대로 이미지 분석 매개 변수를 설정하고 테스트하여 분석 방법을 최적화하십시오.
설정을 저장하고 모든 우물에서 분석을 실행하십시오. 각 웰에서 Q40:YFP 응집체의 총 수로 전체 핵을 내보냅니다. 각 웰의 선충류 수를 세고 각 그룹의 선충 당 평균 Q40 : YFP 응집체 수를 계산합니다.
이어서, 억제지수를 계산한다. polyQ 신경 독성 분석을위한 선충류를 준비하기 위해, HA759 선충류의 300-500 개의 동기화 된 L1 유충을 E.coli의 OP50 균주와 황기 밀리리터 당 5 밀리그램을 포함하는 500 마이크로 리터의 S 배지를 사용하여 48 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 밀봉한 후, 이전에 설명된 대로 M9 완충액에서 선충류를 배양, 수확 및 재현탁합니다.
이제 100ml의 M9 버퍼에 2g의 아가로스를 추가하여 아가로스 패드에서 준비하고 전자레인지에서 용액을 거의 끓을 때까지 가열합니다. 0.5 밀리리터의 녹은 아가 로스를 2 밀리미터 두께의 유리판 두 조각 사이에 놓인 1mm 두께의 현미경 유리 슬라이드의 중앙에 분배하고 다른 슬라이드로 수직으로 덮습니다. 아가로오스가 식고 응고되면 상단 슬라이드를 부드럽게 제거합니다.
아그로스 패드에 20 밀리몰 나트륨 아 지드 (azide atide) 한 방울을 첨가 한 다음 15-20 개의 HA759 선충류를 방울로 옮겨 고정화하여 ASH 뉴런 생존 분석을 시작하십시오. 선충류 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 이제 슬라이드를 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경 아래에 두십시오.
40x 대물 렌즈와 FITC 필터를 선택하여 선충류의 머리 영역에서 GFP 양성 ASH 뉴런을 검출합니다. 각 그룹에서 무작위로 50개 이상의 선충류를 선택하여 머리 영역에 GFP 표지 양측 ASH 뉴런이 있는 선충의 수를 계산한 다음 ASH 뉴런의 생존율을 계산합니다. 삼투압 회피 분석의 경우 중간에 8몰 글리세롤 라인을 생성하여 식품이 없는 NGM 플레이트를 정상 영역과 트랩 영역으로 나눕니다.
그런 다음 글리세롤 라인에서 약 1cm 떨어진 곳에 200 밀리몰 나트륨 아 지드 라인을 펼쳐 글리세롤 장벽을 통과하는 선충류를 트랩 영역으로 마비시킵니다. 각각 약 200 개의 선충류를 각 그룹에 대해 3 개의 복제 플레이트의 정상 영역으로 옮깁니다. 그런 다음 트랩 영역에 1 % 부탄디온 방울을 추가하여 선충류를 유인합니다.
페트리 접시의 뚜껑을 즉시 덮고 섭씨 23도에서 90 분 동안 배양하십시오. 현미경으로 두 구역의 선충류 수를 측정하고 회피 지수를 계산합니다. 트랜스제닉 polyQ 균주 AM141은 체벽 근육 세포에서 Q40:YFP 융합 단백질을 강력하게 발현하며, 이 자동 이미징 및 분석 프로토콜로 식별되며, 그 양은 보호 잠재력을 입증하는 황기 처리에 의해 억제되었습니다.
선충류의 머리 영역에서 GFP 형광 및 양측 ASH 뉴런의 손실은 ASH 뉴런 사멸을 나타냅니다. 이 ASH 뉴런 생존 분석은 Caenorhabditis 우아함 뉴런에 대한 테스트 화합물의 신경 보호 효과를 시각적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 화학 감각 회피 분석은 polyQ 응집에 의해 매개되는 ASH 뉴런의 기능 손실에 대한 효과적인 시험 샘플을 조사하기 위해 사용되었습니다.
섭씨 15도에서 3 일 동안 복사뼈로 처리 한 HA759 선충류의 회피 지수는 0.6 이상으로 증가하여 행동 장애에 대한 다당류의 신경 보호 효과를 입증했습니다. 시험 화합물의 전반적인 신경 보호 능력을 평가하기 위해 개별 분석의 데이터를 통합하여 대조군보다 황기 치료 그룹의 삼각형 면적을 보여주는 레이더 차트로 제시하여 다당류의 항 폴리 Q 효과를 나타냅니다. 음식, 온도 및 습기가 C.elegans의 행동에 영향을 미칠 수 있음을 명심하십시오.
