막스 플랑크 사회와 HB에 괴팅겐 대학원 주니어 그룹의 봉급은이 작업을 지원.

1. 악기, 문화 미디어 및 요리 <ol><li> 초점 샘플을 유지 할 수 있고 그가 자동 단계가 장착되어 현미경을 사용합니다. 주문 제작 뚜껑 히터를 구축하거나 상용 솔루션을 구입할 수 있습니다. 카메라의 노출은 제조업체의 지침을 사용하여 TTL 신호를 통해 LED 조명을 트리거하는 LED-EMCCD 카메라 시스템을 설정합니다. 참고 : 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 : <ol><li> 미세 유체 시설에서 PDMS 스탬프를 제작 또는 상업적 주조에 의해 생성 된 PDMS 스탬프를 가지고있다. 상업적 주조를 사용하려면 장치 (예를 들면 15 μm의) 깊이를 회사의 AutoCAD 파일을 전송하고 지정. 파운드리에서 제공 한 후, 메스를 사용하여 16 우표로 PDMS 칩을 잘라. </li><li> 공기 플라즈마를 이용하여 유리 슬라이드에 개별 스탬프 접합. 접착 용, PDMS 스탬프 및 공기 플라즈마에 유리 슬라이드를 모두 노출시합 1 분 (0.5 mbar에서 높은 플라즈마 설정을 사용하여). 접착을위한 표면이 플라즈마 처리시 위쪽으로 향하도록해야합니다. 그런 다음, 유리 슬라이드에 PDMS 스탬프를 놓습니다. </li></ol></li><li> 3.5 cm 바닥 접시를 타고 수직 밀링 머신과 날카로운 회전 커터를 사용하여 요리의 바닥의 중심에서 18 X 18mm의 사각형 영역을 잘라. 마찰에 의해 생성 된 열에 의해 녹아 플라스틱 않도록 커터 느린 공급의 낮은 회전 속도를 사용한다. 한 번에 여러 요리를 준비합니다. 참고 : 아래 접시 실험 후 여러 번 재사용 할 수는 순수한 에탄올 O / N에 몸을 담근 후 세척됩니다. </li><li> 아가로 오스 : <ol><li> 100ml에 3g 고 융점 아가 디졸브 S-기저 (5.85 g 염화나트륨 1 g을 K 2 HPO 4, 6 g을 KH 2 PO 4 에탄올 1 ml의 콜레스테롤 (5 ㎎ / ㎖), H 2 O 1 L은 비등에 의해) 고압 증기 멸균에 의해 소독. 2 mL의 에펜 도르프 튜브에 아가 로스 STOR 용해의 분취 만들기전자. 또한, 고 융점 아가 정확하게 같은 저 융점 아가로 오스의 배치를 준비한다. </li><li> 98 °의 C - (95)에서 아가 로스 사용 가열 블록 상에 고 융점의 분취 량을 3 배치에 앞서. 35 ° C -이 30 가열 블록에 다음 용융 될 때까지 98 ° C - (95)에서 아가 로스 가열 블록에 사용 저 융점 분취 한 배치에 앞서. </li></ol></li></ol> 동물의 2. 선택 <ol><li> 깨끗한 동물을 얻기 위해 시드 NGM 판에 낮은 밀도로 벌레를 성장. 음식과 단 몇 동물의 많음이 접시에가 있는지 확인합니다. </li><li> 영상 L1 유충를 들어, 신선한 시드의 NGM 접시에 프레첼 단계에서 배아를 포함 약 30 알을 전송합니다. 나중에 유생 또는 성인 C.를 전송 엘레는 신선한 시드 NGM 판에 30 벌레를 전송합니다. </li></ol> 아가로 오스 Microchambers 3. 준비 <ol><li> 요리의 준비 : <ol><li>하단에 18 X 18mm의 정사각형 구멍에 플라스틱 접시를 타고 거꾸로 위를 향 입구에 배치합니다. 오프닝에 20 × 20mm의 양면 접착 테이프의 조각을 배치하여 구멍을 닫습니다. 접착 테이프가 바닥에되도록 요리를 돌아서 및 하드 표면에 접시를 놓습니다. 무료 메스를 사용하여 구멍을 잘라. </li><li> P1000 피펫을 사용하여, 접시에 S-바살 3 % 고 융점 아가 로스 2 ㎖를 채운다. 개방을 둘러싸고있는 영역으로 아가로 오스를 놓고 공고히 할 수 있습니다. 아가로 오스는 고체 때까지 기다립니다. </li><li> 요리 돌아서 접착면이 접시에 남아 노출 될 수 있도록 양면 접착 테이프를 덮고있는 보호 필름을 벗겨. 주 : 결과적으로, 접착 테이프의 미세 링 개구의 외측을 둘러싸는 것. 아가 이후 샘플을 둘러싸는 수분 저류로서 기능한다. </li></ol></li><li> microchambers의 주조 : <ol><li> 일을 노출60 초 - 20 공기 플라즈마로 성형 전자 PDMS 표면. 주 :이 플라즈마 처리는 기포의 포착을 방지하여 선명한 인쇄를 생성하는 PDMS 친수성 ​​표면 렌더링한다. </li><li> 9 유리 슬라이드 - (5)를 적층함으로써 동일한 높이의 두 개의 스페이서를 구축합니다. 장소, 긴 변, 제 1 스페이서 스택 후 단일 유리 슬라이드, 다시 스페이서 스택 평행. 스페이서를 통해 직교 PDMS 스탬프가 들어있는 유리 슬라이드를 놓습니다. PDMS 스탬프의 성형면과 단일 유리 슬라이드 사이에 약 1.5 mm의 공간이되도록 스페이서의 높이를 조정한다. </li><li> PDMS가 액체 아가로 수직 슬라이딩 스탬프 신속 PDMS 스탬프 가까운 단일 유리 슬라이드 상에 뜨거운 액체 고 융점 아가로 오스의 드롭을 배치하고. 아가로 오스가 응고 보자. 그것은 일반적으로 약 2 분 소요 불투명 한 외관을 얻을 수 있는지 확인합니다. 하나의 이동과 수직으로 스탬프를 당깁니다. 참고 : GL 편리UE 스페이서는 양면 접착 테이프와 함께 슬라이드. 우표의 수직 운동은 아가로 오스에 갇혀 얻기에서 공기 방울을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 미세한 백금 와이어 픽업을 사용하여 아가로 오스에 OP50 박테리아와 함께 계란 나 웜을 전송합니다. 속눈썹을 사용하여 음식과 함께 한 계란 또는 챔버 당 하나의 벌레를 배포합니다. 하나 아가로 오스 패드에 약 30 알을 입력합니다. </li><li> 이 접시의 구멍에 잘 맞도록 약 15 X 15mm의 정사각형으로 채워진 microchambers을 포함하는 아가로 오스 슬래브를 잘라. 집게로 광장 아가 슬래브를 들고 20 × 20 ​​mm의 유리 커버 슬립에 뒤집어 놓습니다. 한 번 떨어졌다 다시 들어 올려 또는이 세균과 벌레가 자신의 방 밖으로 밀려 발생할 수 있기 때문에 주위를 밀어하지 않습니다. </li><li> 요리의 조립 : <ol><li> 플라스틱 접시의 개방에 유리 커버 슬립을 놓습니다. 부드럽게 양면 접착 테이프로 만든 반지에 유리 커버 슬립을 누르십시오.유리를 깰 않도록주의하십시오. </li><li> 거꾸로 접시를 뒤집어 30 ° C로 냉각 microchambers 함유 액체 한천 슬래브 저 융점 아가로 오스와 저장조 사이의 갭을 ​​채우기 위해 P1000 피펫을 사용한다. 아가로 오스가 응고 될 때까지 기다립니다. </li><li> 뚜껑 접시를 밀봉합니다. 거꾸로 현미경 가열 뚜껑을 사용합니다. 직립 현미경 정상 뚜껑을 사용하고 파라 필름으로 접시를 밀봉. </li></ol></li><li> microchambers의 준비를 마친 후, 실체 현미경 하에서 여부를 확인합니다. 올바른 충전은 매우 중요하다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li></ol> 4. 칼슘 이미징 <ol><li> 이러한 HBR16 27 ([pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 : UNC-54-3&#39;UTR, UNC-119 (+)] goeIs5)와 같은 유전자 인코딩 된 칼슘 센서를 발현하는 형질 전환 균주를 사용합니다. </li><li> 넓은 필드 표면 형광를 갖추고 복합 현미경을 사용합니다. 에 EMCCD 카메라의 TTL 출력을 연결합니다카메라 샘플 조명 될 프레임을 기록 할 때마다하도록 LED의 TTL 입력. 약 5 밀리의 노출 시간을 사용합니다. 50-300의 범위에서 EM 게인을 사용합니다. </li><li> 매 15 이미지화되는 각 웜에 24 시간 동안 버스트 영화 실행을 지정 - 먼저 30 분 (DIC) 20 초, GCaMP를 기록하고 mKate2 신호의 최종 이미지를 취할 GFP의 형광 20 초에 촬영 발현 수준의 제어. 각 버스트 동안 2 / 초의 프레임 속도를 사용한다. </li><li> 비주얼 데이터 검사 용, 형광 강도의 작은 변화의 시인성을 향상시키기 위해 거짓 컬러 맵을 사용한다. F는 형광의 평균 기본 가치와 ΔF / F와 같은 플롯 형광 데이터,. 칼슘 데이터 분석의 상세한 설명은 문헌 (20)에서 찾을 수있다. </li></ol> 여러 웜 5. 병렬 AMI <ol><li> 현미경에 microchambers을 포함하는 접시를 놓고 샘플에 집중하고 autofo 참여기분이야. 카메라 웜 당 1,920 프레임 데이터의 적절한 양을 초래할 것이다 : 24 시간, 20 초에서 30 분마다 시간을 40 이미지 프레임의 버스트를 획득하도록 소프트웨어 프로토콜을 설정한다. 이 단계를 사용하여 각 벌레를 방문 할 수 있도록 검색을 설정합니다. 하나 실행에 약 30 벌레를 촬영하는 것을 목표로하고 있습니다. </li><li> 낮은 배율을 사용하여, 즉, 축소하여 이미지 여러 웜. 카메라 칩으로 여러 microchambers을 커버하고 동시에 여러 인접 microchambers을 필름에 낮은 배율을 사용합니다. 화상 취득의 종료 후, 동물을 다루는 하나의 관심 영역을 잘라내어 개별 챔버에 대한 데이터를 분리한다. </li><li> 빠르게 이동 데이터를 평가하기 위해, 프레임 빼기 28-32을 사용합니다. </li></ol> C의 6 이미징 다른 생활 단계 엘레 <ol><li> C의 모든 삶의 단계에 대한 아가로 오스 microchambers를 사용하여 엘레 (L1)에서 성인을 포함 dauers에. DIF에 해당하는 실 치수를 사용하여표 1에 나타낸다 ferent 수명 단계. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 생활의 단계 </td><td> 챔버 크기 </td><td> 챔버 깊이 </td><td> 일반 녹화 시간 </td><td> 확대 </td></tr><tr><td> (L1) </td><td> 190 X 190 μm의 </td><td> 10-15 μm의 </td><td> 달걀 - 중간 (L2) </td><td> 400X </td></tr><tr><td> (L2) </td><td> 370 X 370 μm의 </td><td> 15 μm의 </td><td> 달걀 - (L3) </td><td> 200X </td></tr><tr><td> 영속 유충 </td><td> 370 X 370 μm의 </td><td> 25 μm의 </td><td> 사일 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> (L3) </td><td> 700 X 700 μm의 </td><td> 45 μm의 </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> (L4) </td><td> 700 X 700 μm의 </td><td> 45 μm의 </td><td> 젊은 L4 - 젊은 성인 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 젊은 성인 </td><td> 700 X 700 μm의 </td><td> 45 μm의 </td&gt; <td> 12-24 시간 </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> 서로 다른 삶의 단계 표 1. 회의소 크기. 표시됨은 8 × 8mm 카메라 칩에 최적화 된 다양한 단계에 유용 챔버 크기와 배율.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li><li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

하드웨어 현미경의 초점은 전형적으로 장기간의 화상 획득 동안에 드리프트 할 것이다. 복합 현미경, 초점을 지키는 시스템하는 주요 현미경 제조 업체에서 구입하실 수 있습니다. 포커스 제어와 화합물 현미경 너무 비싼 인 경우에, 간단한 대안은 실체 현미경을 사용하는 것이다. 화합물 현미경은 높은 개구 수 (NA)가 목표의 사용을 허용하고 용이하게 자동화 될 수있다. 40X 오일 목표는 적합하다. 침수 렌즈 때문에 장기 이미징 동안 증발의 이상적인 수 없습니다. 미분 간섭 대비 (DIC)는 형태 학적 및 행동 변화를 수행하는 데 도움이 좋은 대비를 생성하지만 간단한 시야 촬상 또한 사용될 수있다. DIC 또는 시야 이미징, 현미경의 직경 - 조명 경로로 붉은 빛이 필터를 배치하여 붉은 빛을 사용합니다. 여러 microchambers 스캐닝하기위한 자동화 단계가 필요하다. 최고의 성능을 교류입니다스테이지 비선형 가속과 감속을 가지며, 주사시 동물을 방해하지 않도록 낮은 주사 속도로 설정 될 수 사용될 때 hieved. 우리는 웜의 mechanosensitive 시스템을 활성화하지 않습니다 실제로 그 느린 스캔을 제안 행동 반응 또는 스캔하는 동안 mechanosensitive 뉴런 (ALM 및 PLM)에서의 칼슘 증가를 관찰하지 않은 (데이터가 표시되지 않음). 상용 LED 시스템을 사용할 수있다. 몇몇 회사는 서로 다른 파장의 LED를 포함 즉시 사용 가능한 솔루션을 제공합니다. LED 외부 TTL 신호와 LED 트리거링 옵션을 가져야한다. 고감도 카메라 동물 이동 칼슘 이미징 필요하다. EMCCD 카메라는 시장에서 가장 민감한 카메라이다. 카메라는 노출시 TTL 출력 (또한 &quot;화재&quot;출력)를 가질 필요가있다. 뚜껑 히터 거꾸로 현미경을 사용하는 경우에는 뚜껑에 응축을 방지 할 필요가있다. 직립 현미경에서 접시가 배치 될 수 있도록 뚜껑 WI하단에하고 것이다 따라서 결로를 방지하고 더 뚜껑 가열이 필요하지 않습니다. 뚜껑 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 접시를 닫고 단단히한다. PDMS 스탬프 아가 로스를 성형하기위한 구조를 포함 PDMS 스탬프의 표면 거리 PDMS 스탬프를 지원 유리 슬라이드에서 직면된다. 사용자 정의 마이크로 유체 칩을 제공하는 회사와 목록은 위키 백과에 (찾을 수 있습니다 <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> )을. 자신의 방에 선충을 작성 이것은 프로토콜의 가장 중요한 단계이며, 다음 사항이 고려되어야한다 : A), 아가 로스의 보습이 벌레를 전송 및 이미징에 매우 중요하다. 아가로 오스, 즉, 너무 습하면, 액체 COV가여러 microchambers의 면적 거릴, 그것은 액체 박테리아 멀리 흐르게하므로 제어 된 방식으로 박테리아와 웜 식품을 분배하는 것이 가능하지 않을 것이다. 아가로 오스가 너무 건조하면 다음과 세균과 벌레가 증가 힘이 쉽게 아가로 오스의 손상을 일으키는 벌레와 박테리아를 삭제하는 데 사용 될 필요가 있음을 의미 쉽게 선택을하지 못할 수도 있습니다. 웜을 많이 채울 때 아가로 오스는 건조 할 수있다. 최악의 경우 아가로 오스는 챔버가 붕괴 될 그래서 결국 건조 될 것이다. 아가로 오스가 너무 건조한 경우에는 웜이없는 칩의 측면 상에 작은 방울 S-기저 (약 2 μL)를 배치하여 재수 화 될 수있다. 그런 다음 액체로 선택 백금 와이어를 찍어 심지어 챔버가 벌레로 가득 영역에 액체의 일부를 빼냅니다. B) 음식의 양을 성공적으로 장기 촬상 중요하다. 충분한 음식이없는 경우, 웜은 부족할 수있다. 과도한 음식은 챔버의 캐비티가 있다면액체처럼 오히려 고체처럼 행동하지 않으며 벌레가 박테리아를 밀어 챔버에서 탈출 할 수 있습니다. 전체 챔버를 채우는 세균 현탁액을 획득하는 것을 목표로하고 있습니다. 벌레는 실험 기간 동안 그들의 길이의 대부분을 따라 한천과 유리 표면에 일정한 물리적으로 접촉하고 크롤링 동작은 액체에서 탈곡하는 접시에 운동과 유사과 유사하지 않은 것으로 보인다. 실험을 망칠 수 아가로 오스의 손상 C) 기계. 좋은 선택이 필수적이다. 그것은 날카로운 모서리가 없어야합니다. 피펫 팁에 부착 소프트 속눈썹은 백금 픽업을 사용하는 대신 챔버 내로 박테리아 나 웜을 이동하는데 사용될 수있다. 그러나 대부분의 경우, overdried 아가 손상에 대한 이유이다. 픽업 또는 속눈썹이 이상적 간신히 웜 및 박테리아 해내한다 아가로 오스 상에 자체 및 수막을 터치한다. 챔버를 밀봉 할 때, 다시, 아가 로스의 수분이 필수적이다. 이하지 말아야이 밀봉 동안 세균과 벌레를 씻어 수 있기 때문에 아가로 오스 표면에 어떤 무료 액체를합니다. 큰 기포가 부드럽게 한천 슬래브의 모서리를 해제함으로써 제거 될 수있다. 자주 챔버 안에 갇혀받을 실보다 작은 작은 거품. 이러한 거품은 문제가되지 않습니다 및 흡수에 의해 사라집니다. 접시를 조립 한 후, 아가로 오스가 너무 건조하거나 젖은 것을 다시 확인합니다. 챔버는 잘 밀봉해야하며, 챔버 사이에 액체의 흐름이 안됩니다. 아가 너무 젖은 경우 챔버가 제대로 밀봉되지. 웜 탈출하거나 그들의 음식은 멀리 세척한다. 샘플이 너무 습하면, 간단한 뚜껑을 열고 2 분의 아가로 오스 건조를 할 수 있습니다. 아가로 오스가 너무 건조하면 챔버는 붕괴 할 수 있으며, 웜 탈출합니다. 축소에 의해 확장 형광 이미징의 경우, 축소하는 낮은 배율에서 얻어진 빛의 적은 양에 의해 제한된다. 또한, 전자MCCD 카메라는 감도에 최적화 종종 상대적으로 낮은 해상도를 가지고있다. 그러나 영상 4 배 규모를 확대하는 것은 물론 가능하다. 140X (20X 목적 및 0.7X 카메라 마운트를 사용하여 달성) 배율 및 512 X 512 화소, 8 × 8 mm 카메라를 사용할 때 예를 들어, 190 μm의 X 190 μm의 네 챔버는 하나의 프레임에 맞게 할 수있다. (예 : sCMOS 카메라, 16.6 mm X 14mm 칩, 2560 X 2560 픽셀 = 5.5 메가 픽셀)을 큰 칩과 고해상도 카메라는 DIC와 밝은 필드 이미징의 최대 확장 최적화합니다. 100X 배율을 사용하는 경우 예를 들어, 190 μm의 30 L1 벌레까지 X 190 μm의 챔버 (도 3 참조)이 카메라의 각 프레임에 맞게 할 수있다. 원칙적으로, 줌 아웃 및 주사는 동물의 더 큰 수를 획득하기 위해 결합 될 수있다. 하나의 초점 평면 이미지를 만들 필요가 있도록 대부분의 뉴런은 초점이 꽤 잘있어. 뉴런 피에조 드라이브를 사용하여 검사를 AZ, 초점이 이동하는 경우에 발견되는 각각의 시간 (P)에 취해질 수OINT. 다른 동작에 적응 이 프로토콜은 긴 시간 규모에서 행동의 좋은 아이디어를 제공합니다. 물론, 버스트의 타이밍은 다른 동작과 생활 단계에 적응 될 필요가있다. 기술의 한계 여러 가지 요인이 영상의 지속 시간을 제한 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 음식의 양이다. 음식이 소비되면, 유충 개발 중지합니다. 따라서, 작은 실에서 (190 X 190 μm의) 웜은 L3 단계까지 개발 한 후 체포. 이상 촬상 시간이 필요하다면, 더 큰 챔버가 사용될 수있다. 3 일 - 장기 영상의 최대 길이는 2.5의 범위이다. 이상 촬상이 필요한 경우, 웜을 회수하고 새로운 챔버에 배치 될 필요가있다. 성인 벌레를 이미징 할 때, 다른 제한은 이러한 웜의 자손에 의해 발생합니다. 성인 벌레는 유충 부화에서 알을 낳는다. 이 유충은 챔버 내부에 남아있을 것입니다식품을 소비하고, 이미지 분석을 방해 할 수있다. 자손이 문제가 될 경우에는, 멸균 성인 용액을 사용하거나 또는 신선한 챔버로 벌레를 반복적으로 배치하는 것이다. 벌레를 복구하기 위해, 챔버를 포함하는 아가로 슬래브 메스 자유로운 절단은, 커버 슬립을 뽑아되며 웜을 회수 할 수있는 NGM 플레이트 상에 배치된다. 또 다른 한계는 상대적으로 작은 지역에 벌레의 제한 사항입니다. 장거리 이동 분석되어야 할 경우 문제가 될 수있다. 챔버에 동물을 기계적 optogenetically 21,27,34,35 자극 될 수 있으나, 챔버의 밀봉 특성 어려운 가용성 또는 휘발성 자극을 적용 할 것이다. 산소 또는 이산화탄소와 같은 생물학적으로 중요한 가스 한천에서 자유롭게 확산 할 수있다. 접시에 큰 공기 탱크는 실험에 필요한 시간에 걸쳐 일정 챔버의 가스 농도를 유지해야합니다. 그러나, 마음 로컬 산소 concentratio에 보관해야N 실에서 더 많은 접시에 문화보다 액체 문화에서 발견되는 조건과 유사 할 수 있습니다. 기존의 방법에 대한 의미 미세 유체 장치는 크게 C에서 공부 행동 및 발달 고급 엘레. 종종, 미세 유체 구조는 PDMS (12)로 만들어진다. 여기서 우리는 아가로 만든 미세 배양 챔버를 생성하는 프로토콜을 기술한다. 이 기술의 장점은 높은 품질 영상화, 생리적 측정 장기 이미징 및 합리적으로 높은 처리량과 행동의 상관의 조합이다. 고화질 높은 NA를 사용하여 목표 유리 커버 슬립으로 촬상함으로써 달성된다. 그 결과, 칼슘 이미징 및 세포 내 구조물의 촛점 이미징 형광 촬상을 행할 수있다. 동물이 다른 시스템들에서와 같이 고정되지 않기 때문에, 그 생리 학적 측정과 행동의 상관을 허용한다. 벡ause 동물이 충분한 음식을 가지고, 이들은 장기간 촬상있게 계속 개발. 이 시스템은 동물 정의 된 챔버에 하나 실행에 이미지 많은 벌레 제한 할 수 있기 때문이다. 따라서,이 방법은 쉽게 9,27,34-36을 확장 할 수 있습니다. 미래의 응용 프로그램 지금까지,이 시스템은 C. 수면 행동을 연구하기 위해 주로 사용되어왔다 엘레 L1 유충. 그러나, 모든 단계에 대한 적응이 가능 또한 dauers 및 성인에서 행동의 넓은 범위를 공부하게됩니다. 행동의 광범위한는 짝짓기에서 달걀 누워에 이르기까지이 방법으로 공부하실 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

동작은 신경계에 의해 조절된다. 칼슘 이미징 Caenorhabditis 엘레 다양한 동작 중에 뉴런의 활성을 측정하기 위해 투명 간스 선충에 간단한 방법이다. 행동 신경 활동의 상관 관계, 동물 고정화되지 않아야하지만 이동할 수 있어야한다. 많은 행동 변화는 긴 시간 규모 동안 발생과 행동의 많은 시간 동안 기록이 필요합니다. 이것은 또한 배양하는 데 필요한 식품의 존재에 웜을 만든다. 어떻게 웜 배양과 신경 활동은 긴 시간 규모에 걸쳐 영상화 할 수 있습니까? 아가로 오스 Microchamber 이미지 (AMI)는 이전에 문화를 개발하고 작은 유충을 관찰하고 지금 C의 성인 무대까지 초기 (L1)의 모든 삶의 단계를 연구하도록되어 있었다 엘레. AMI는 C의 다양한 삶의 단계에서 수행 할 수 있습니다 엘레. 장기 칼슘 이미징 COM 짧은 노출 외부 트리거를 사용하여 동물을 고정하지 않고 달성된다전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 녹화 전자 증배 bined. 축소 또는 스캔은 병렬로 40 벌레까지 이미지에이 방법을 확장 할 수 있습니다. 따라서, 방법은 C의 모든 삶의 단계에 긴 시간 규모에 걸쳐 이미지의 행동과 신경 활동에 설명 엘레.

아가로 오스는 microchambers C. 임의 생활 단계에 적용될 수있다 엘레. 도 1a에서 알 수있는 바와 같이, L1에 lethargus 동안 유생 수면 행동이 관찰 될 수있다. 깊은 190 X 190 μm의, 10 μm의 아르 챔버 크기는있는 바와 같다. 장시간 스케일이 필요한 경우,보다 큰 챔버가 사용될 수있다. 더 큰 크기 (370 X 370 ㎛ 인, 25 ㎛의 깊이)와 챔버를 사용하여,도 1b에서 알 수있는 바와 같이, C.의 개발을 허용 엘레 계란에서 성인까지. 그림 1C 성인까지 알에서 챔버에서 자란 벌레의 프레임 빼기를 사용하여 동작의 장기적인 변화의 분석을 보여줍니다. 웨이크 및 lethargus 중 선택 버스트 프레임 공제 후 평균 강도가 표시됩니다. 웜의 이동성 낮은 프레임 빼기 값 이후의 평균 강도가 낮을​​. 표시 한 웨이크 상태와 애벌레 단계 당 하나의 lethargus 조건에서 버스트 흔적을 선택한다.개발하는 동안 평균 강도의 관찰 증가는 동물의 증가 대비 및 크기에 주로 기인한다. 그림 1D는 영속 유충, 불리한 환경 조건 33시에 종사하는 다른 삶의 단계를 보여줍니다. 챔버 크기는 370 X 370 μm의, 15 μm의 깊이. 영속 유충 단계에서 종료를 야기하는, 영속 유충이 박테리아 음식없이 챔버에 넣고 있습니다. 그림 1E는 이미 챔버로 많은 계란을 누워있다 성인 벌레를 보여줍니다. 성인에 사용되는 챔버 크기는 깊이 700 X 700 μm의, 45 μm의했다. 마지막으로, 그림 1 층은 성인 자웅 동체 및 성인 챔버 내부의 남성 짝짓기를 보여줍니다. 운동성이 웜에 칼슘 이미징. GCaMP 칼슘 센서 가능합니다 2A, L1 유충 (27)에 대한 명령 interneuron AVA의 B 쇼 칼슘 이미징 피규어. 2c는 SA를위한 칼슘 활성을 나타내는 D,도성인 동물에서 신경 세포의 날 유형. 장기 영상을 스케일링 주사함으로써 확대 및 축소가 가능하다.도 3a는 5 메가 픽셀 카메라로 하나의 카메라 칩 (30)의 웜 동시 촬상의 화질을 도시한다.도 3b는 동시에 묘화 4 웜 칼슘의 이미지 품질을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> C의 모든 삶의 단계에 AMI 1. 적응 그림 190 X 190 μm의 챔버에서 초기의 L2 단계까지 이른 (L1)에서 몇 군데 간스. (A) 유충. 370 X 370 μm의 챔버에서 성인까지 달걀에서 (B)를 개발. 웜의 (C) 이동성 프레임 빼기를 사용하여 평가 하였다. 각 유생 역에 대해 하나의 선택 버스트 영화 프레임 공제 후 이미지의 모든 사진의 평균 강도는 표시합니다웨이크 및 lethargus 행동 GE. 370 X 370 μm의 챔버에서 음식의 부재 (D)의 영속 유충. 700 X 700 μm의 챔버에 배치 많은 계란 (E) 성인 자웅 동체. (F) 남성의 결합 및 700 X 700 μm의 챔버 내부의 자웅 동체. 나중에 젊은 성인을 의미한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> AMI 그림 2. 칼슘 이미징. AVA NMR-1 프로모터를 사용하여 L1 유충의 명령 interneuron에 GCaMP3와 () 칼슘 이미징. 두 거짓 컬러 이미지를 나타낸다. 왼쪽 이미지에서 AVA의 활성이 낮고, 웜은 역방향 운동을하지 않는다. 오른쪽 그림에서 아바의 활동이다<html> 높은 및 웜은 뒤로 이동합니다. (L1) 웜 시간 이상 (B) 칼슘 과도. (C, D) 성인 동물의 칼슘 과도를. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> 축소에 의해 병렬로 그림 3. 이미징 여러 웜. (A) 동시 190 X 190 μm의 챔버를 사용하여 프레임 당 30의 L1 웜의 이미징 및 100X 배율 (10 배 목표를 사용) 및 16.6 X 14mm 카메라 칩. (B) 370 X 370 μm의 챔버 및 100X 배율과 16.6 X 14mm 카메라 칩의 관심 영역을 사용하여 프레임 당 사 (L3) 웜의 동시 영상.등 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.4K 조회수.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

비디오: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. 엘레간스 긍정적인 Butanone 학습, 단기 및 장기 연관 메모리 Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

연구

신경과학

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

에이<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 영양 상태 기반 구리 혐오 검정

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

신경이없는 세대의 장기간 유지 관리<em&gt; 히드라</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...