우리는 프로토콜을 개발하는 데 도움 특히, 여기 원래 프로 시저를 개발 긴 폰트를 설명하는 링크 실험실의 현재와 전 회원에게 감사를 표합니다. 이 작품은 CDL에 NIH (AG12423) 및 알츠하이머 협회 (제니스 대상)에서 수상에 의해 지원되었습니다

1) 마비 분석에 대한 선충류 성장 미디어 번호판을 준비. 마비의 assays는 정기적으로 C.에 사용되는 표준 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 수행됩니다 엘레간스 전파 및 유전학 (Stiernagle, 2006). <ol><li> NaCl, Erlenmeyer 플라스크에 아가르 및 펩톤가 포함된 NGM 솔루션을 압력솥 및 살균 CaCl 2, 유라실, 콜레스테롤, 1M MgSO 4와 1M KPO 4의 적절한 금액을 추가합니다. 각 60mm X 15mm 페트리 접시에 액체 NGM의 나누어지는 10 ML. NGM는 실온에서 하룻밤 응고 수 있습니다. </li><li> 각 플레이트에 화합물 / 추출, 나누어지는 추출물의 효과에 대한 테스트 및 균일하게 접시의 표면에 걸쳐 추출을 배포하는 확장기를 사용하는 경우. 실온에서 하룻밤 건조 추출 수 있습니다. 1 ML 이상의 볼륨은 건조 시간이 더 필요합니다. </li><li> E. 250 μL와 각각의 접시 스팟 콜리 변형 OP5O는 0.4-0.6의 광학 밀도에 대한 야간 LB 미디어 재배. 박테리아가 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 관련 변수 접시의 나이는 나이가 접시 밖으로 건조하는 경향으로 마비 분석에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 사용 번호판 마비가 분석 한 주일 이내에 부어. 이상의 결과를 얻으려면, 3-4일 [(2) 아래 참조] 동기 웜 인구의 개시 전에 접시를 붓는다. 모든 실험은 같은 배치에서 부어 접시만을 사용합니다. 잔디밭의 크기 (즉, 발견 대 보급) 및 / 또는 박테리아의 종류를 변경하면 벌레의 동작을 변경합니다. 마비의 assays는 대체 E.를 사용하여 수행할 수 음식 소스 (예 : RNAi 실험을 먹이에 사용되는 HT115 변형)하지만,이 때문에 적절한 내부 통제가 필요 마비의 속도론을 변경할 수있는 대장균의 변종. 연령 동기 웜 인구 2) 준비 스트레인 CL4176 (smg - 1 (cc546 TS) I; dvIs27 [묘는 - 3 /는 Aβ minigene는 + rol - 6 (su1006) 마커 유전자]는 X 가장 일반적으로 Aβ 유발 마비 시금에 사용이 부담 및 기타 유전자 변형 모델을 사용할 수 있습니다. Caenorhabditis 유전학 센터 (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)에서 소정의 수수료 학술 연구자 수 있습니다. <ol><li> 그것이 동기 부모 세대와 함께 시작하는 것이 바람직합니다 테스트 인구의 연령 synchrony을 극대화합니다. 주일 전에는 시험 인구의 마비 분석을 시작, 16 시에 누워 2 시간 달걀에 대한 OP50로 확산 여러 10cm의 NGM 플레이트에 20-30 gravid 성인 전송하는 플래티넘 웜 선택 도구를 사용하여 ° C (CL4176에 대한 허용 온도 ). gravid 어른을 제거하고 자손 어떤 시간에 그들이 gravid 성인 &quot;두번째 날&quot;될 것입니다 7 일 동안 성장할 수 있습니다. </li><li> (1 일) 두 번째 일 gravid 성인 연령 동기 테스트 인구를 준비하는 데 사용됩니다. 각 실험 조건에 대해 개체가 50-75 연령 동기 벌레가 들어있는 세중의 플레이트를 생성하는 것입니다. 플래티넘 웜 선택 도구를 사용하여 OP50와 함께 발견 60mm (10 ML 볼륨) NGM 플레이트에 2 일 gravid 성인의 10-12를 전송할 수 있습니다. 웜은 다음 어른을 선택하고 계란이 부화 수 있도록 16에서 성장, 2 시간 동안 16 ° C에서 알을 낳기 위해 ° C. 허용 이 시점에서 그것을 코드에 번호판을 채점하지 않습니다 누군가를 위해 최상이고, 득점은 실험 조건에 장님이 될 것입니다. </li></ol> 관련 변수 계란이 여자랑 아르 배아 발달의 단계 (~ 최적의 조건 하에서 야생 타입 벌레에 대한 26 세포 단계)가 성인 연령과 영양의 기능입니다. 테스트 인구의 준비에 사용되는 gravid 성인 나이가 아니면 굶어 죽었을 경우, 나중에 무대 달걀은 인구 및 마비의 속도론의 재현성의 나이 synchrony 감소 마련됩니다. 그것은 문화가 (미생물 오염이 심각한이 분석에 영향을 줄 수 있습니다) 사용되는 모노 axenic (즉, 전용 OP50 박테리아)보다 필수적이며, 세중의 플레이트는 벌레 비슷한 숫자가있는 경우 재현성이 높은 것입니다. 3) Transgene 유도 및 마비 분석 <ol><li> (3 일) 25 Upshift 번호판 ° C 48 시간 동기 계란의 끝 이후에 누워, 벌레는 세 번째 단계 애벌레 (L3)에 있어야합니다. 접시는 모든 접시가 동시에 25 ° C에 도달 수 있도록 25 ° C 배양기에서 스태킹없이 배치하여야한다. </li><li> (주 4) upshift의 개시 후 18-20 시간에 벌레의 마비 (변형 CL4176)를 채점 시작합니다. 이 시점에서, 인구의 모든 벌레는 네 번째 애벌레 (L4) 단계에 도달한다. 접시의 각 모든 벌레가 마비가 될 때까지 두 시간 단위로 계속 점수. 알 수없는 이유로 마비도 신체의 길이에 걸쳐되지 않습니다 머리 지역은 이동 중단에 대한 웜의 마지막 부분입니다. 따라서, W최근 마비를 시작했습니다 옴스은 접시를 통해 번역할 수는 없지만,이를 통해 자신의 앞쪽에 주변 박테리아를 지우고 삭제 박테리아의 &quot;후광&quot;를 떠나, 그들의 머리를 이동할 수 있습니다. 이 벌레는 결국에 완전히 마비 될 것입니다, 그리고 마비로 따라서 halos과 벌레가 분류됩니다. 일부 웜은 halos을하지 않습니다뿐만 아니라 자발적인 움직임을 보이지 않습니다, 이러한 웜 따는로 괴롭히는하여 테스트합니다. prodded 웜이 괴롭히는시 몸 전체에 웨이브 전파를 받아야 수없는 경우 마비로, 그것도 점수입니다. 효율적인 채점을 위해, 그것은 그들이 실수로 다음 채점 기간을 rescored되지 않습니다 않도록 접시의 얼룩이없는 분야에 마비가 벌레를 이동하는 가장 쉬운 방법입니다. (이 또한 점수 정정을 허용함으로써, 잘못 분류 웜은 움직임을 보여줄 수 있습니다.) </li><li> 마비 곡선을 생성하려면 각 시점에 마비되지 않은 각 접시에 벌레의 분율은 비율로 변환되며, 평균 &quot;unparalyzed&quot;비율 upshift 개시부터 시간이 역모를 꾸몄다입니다. (이 방식으로 음모를 꾸미고에 대한 근거는 결과 곡선은 생존 곡선을 공식적으로 유사하고, 따라서 표준이 아닌 파라메 트릭 생존 통계를 사용하여 분석할 수있다.) </li></ol> 관련 변수 그들이 묘 - 3 발기인이 발달 규제로 시작되어야하고, 상당히 늦은 L4 또는 성인 웜의 표현을 감소했습니다 마비에 대한 중간 L4 단계에 도달하기 전에 유전자 변형 myo-3/Aβ의 웜의 upshift가 발생합니다. 마찬가지로,이 transgene 표현이 웜은 굶어 될 경우 차단하므로 벌레들이 실험을하는 동안 잘 공급되는 필수입니다. 그들이 16 ° C.에 downshifted 경우에도, 우리는 어떠한 조건에서 복구하기 마비 벌레 관찰 적이 있고, upshift의 12-16 시간 후, 모든 CL4176 벌레가 마비됩니다 변형 CL4176에서 transgene 표현의 충분한 upregulation 마비의 타이밍이 변경될 수 있지만 마비 (즉, 20-25 ° C) 낮은 온도에서 발생할 수 있습니다 발생할 수 있습니다. 마비의 비율이 사용하는 특정 유전자 변형 응력 (우리가 CL4176보다 빠르고 느린 속도 모두 myo-3/Aβ 변종을 만들었다는)에 의존하므로 다른 변종으로 점수 창이 조정해야 할 수도 있습니다. 4) 대표 결과 치료과 카페인 6.27 MM (NGM 플레이트에 최종 농도)에 노출 모두에 대해 CL4176 마비 곡선의 플롯은, 그림 1에 표시됩니다. 이 치료 우리가이 모델의 Aβ 독성의 억제 기준으로 나타내는 해석 약 4 시간의 마비에 높은 통계적으로 의미있는 지연을 초래합니다. 그림 2에 표시된 것은 cafestol, 커피에있는 다른 화합물의 효과를 시금 독립적인 실험이다. 이 음모는 Aβ 독성에 영향을주지 않습니다 치료에 대한 일반적입니다. 두 실험의 절반에 대한 치료 CL4176 인구가 24 시간에서 마비 및 마비 28 시간으로 완료됩니다. 이러한 제어 CL4176 인구의 마비에 대한 전형적인 timeframes 있습니다. 이시기의 중요한 편차는 변경 환경 조건이나 transgene 사본의 자발적인 삭제 나타내는 있습니다. (CL4176은 myo-3/Aβ transgene의 복사본이 여러 개있는 chromosomally 통합 유전자 변형 배열이 포함되어 있습니다.이 유전자 변형 배열이 정상적으로 상당히 안정이지만, 온도에서 변형의 전파는&gt; 16 ° C는 A를받은 희귀한 벌레에 대한 선택합니다 Aβ 표현과 느린 마비 결과를 감소해야합니다 변종의​​ 발생 transgenes의 자발적인 삭제,.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. CL4176 웜 치료 또는 6.27 MM의 카페인 (시그마)에 노출 변형율에 대한 마비의 ​​곡선. 표시된 시간은 온도 upshift의 개시부터입니다. 오류 바 = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 0.48 MM cafestol (시그마)에 노출 CL4176 벌레에 대한 마비 커브. 오류 바 = SEM

<ol>
	<li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer's+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans.">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li><li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta.">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li><li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer's+disease+amyloid+beta-peptide+(1-42)+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model.">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li><li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants.">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li><li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans.">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li><li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein.">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li><li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리가 설명이 프로토콜은 효율적으로 분석 Aβ 독성에 대한 화합물의 효과를 위해 사용될 수 있습니다. 게시 예제는 징코 빌로바 추출물의 성분의 영향 (우 외. 2006)과 reserpine을 (아리아 외. 2009 년) 등이 있습니다. 다른 시스템에서 Aβ 독성에 대한 보호되었습니다 화합물도 (예, memantine, 우리되지 않은 결과)이 모델에서 보호하는 표시되었습니다. 이 모델 수립을위한 중요한 근거는 C.에서 잘 개발된 유전자와 분자 도구를 사용할 수 있습니다 엘레간스는 Aβ 독성의 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 Aβ 독성에 미치는 영향 특정 돌연변이 (예, DAF - 2 손실 기능 돌연변이, Florez - 매클루레 외. 2007 년 도입하여 신호와 같은 인슐린을 줄이는 효과) assayed,이 모델은 또한 수 있습니다 과잉 표현 transgenes (폰트 외. 2008)의 영향을 조사하는 데 사용됩니다. 우리는 최근 Aβ의 단일 아미노산 대체 (게시되지 않은 데이터)의 독성에 미치는 영향을 조사하기 위해이 모델의 광범위한 사용을 만들었습니다. 유전자 변형 모델은 assays에게 여기에 근육 세포 기능에 급성 Aβ 표현의 효과를 설명했다. 마비 근육 세포 및 sarcomere 시에 손상되며, 마비의 표현형 근육 세포 사망의 결과 없습니다. 그러나, 마비 후 (초기 upshift 후 ~ 48 시간) 근육 무결성 및 웜의 최종 죽음의 고장이 있습니다. 우리는 Aβ 표현이 다운 스트림 효과를 조사하거나 독성 표지로 사용하지 않았습니다. 여기에 설명된 inducible의 Aβ 표현 모델은 글 β - 아밀로이드 형성을 조절 치료를 조사에 적합하지 않습니다. 제정 Aβ 표현 양식을 쉽게 감지 아밀로이드 침전물과 함께 유전자 변형 벌레가지만 (.. 페이 외 1998; 링크 외 2001), inducible의 Aβ의 표현과 함께 유전자 변형 벌레 거의 아밀로이드 침전물이없고 마비의 표현형은 아밀로이드 증착 (드레 이크 외 독립 나타납니다. 2003). 결과는보기와 일치하는 가용성 oligomeric Aβ의 축적이 아니라 아밀로이드 증착에서 유도 Aβ 표현 결과의 급성 독성.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> Quantity/2L </td><td> 회사 소개 / 카탈로그 # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> 시그마 - 알드리치 /​​ S9888 </td><td></td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 40g </td><td> 시그마 - 알드리치 /​​ A7002 </td><td></td></tr><tr><td> 펩톤 </td><td> 5g </td><td> 시그마 - 알드리치 /​​ P0556 </td><td></td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2mL </td><td></td><td> ddH 2 O에서 147.02mg/mL </td></tr><tr><td> 유라실 </td><td> 2mL </td><td></td><td> ddH 2 O에서 2mg/mL </td></tr><tr><td> 콜레스테롤 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 에탄올의 5mg/mL (압력솥하지 않음) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2mL </td><td></td><td> ddH 2 O에서 246.5mg/mL </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ddH 2 O, 산도의 ML, 48mg K2HPO4/mL </td></tr><tr><td> Erlenmeyer 플라스크 </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying &beta;-amyloid toxicity using a transgenic c. elegans model

β - 아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 축적은 일반적으로 알츠하이머 질병의 유도 중심으로 생각하지만, 독성의 관련 메커니즘 (들)은 아직 명확하지가있다는거다. Aβ는 또한 포함 바디 Myositis, 심한 인간 myopathy에 intramuscularly 입금됩니다. 강렬한 공부 선충류 웜 Caenorhabditis의 엘레간스는 transgenically 인간의 Aβ를 표현하기 위해 설계하실 수 있습니다. Aβ 표현의 조직이나 타이밍에 따라, 유전자 변형 벌레는 Aβ 독성의 읽기 아웃 역할을 쉽게 측정 phenotypes 수 있습니다. 세스 외, 예를 들어, 범 -의 연결 Aβ 표현과 함께 유전자 변형 벌레가 제정 근육 특정 표현과 함께 유전자 변형 웜은 프로 그레시브, 나이에 의존 마비의 표현형을 (링크 1995 표시하면서 결함이 연관 학습 (. Dosanjh 외 2009)입니다했습니다 . 2006). 하나는 특히 유용 C. 엘레간스 모델은 온도 upshift (링크 외. 2003)에 재현할 마비의 표현형의 결과, Aβ transgene의 온도 inducible 근육 표현을 엔지니어로 mRNA 감시 시스템의 온도에 민감한 돌연변을 사용합니다. 이 모델에서 카운터 Aβ 독성이 [예, 보호 transgene (핫산 외. 2009)의 표현이나 징코 빌로바 추출물 (우 외. 2006)에 노출] reproducibly 이러한 유전자 변형의 온도 upshift에 의해 유도된 마비의 속도를 변경할 것을 처리 웜. 여기 우리는이 유전자 변형 C.에 마비의 속도를 측정을위한 프로토콜을 설명 이 측정에 영향을 미칠 수 실험 변수에 특히주의와 엘레간스 모델.

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Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

강렬한 공부 선충류 벌레<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em&gt;는 transgenically 인간 β - 아밀로이드 펩타이드를 (Aβ) 표현하는 설계하실 수 있습니다. 의 Aβ의 유도 표현<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 근육은 Aβ 독성을 조절 치료를 모니터링하는 데 사용할 수있는 신속하고 재현할 마비의 표현형로 ​​연결됩니다.

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

25.2K 조회수.  University of Colorado. 강렬한 공부 선충류 벌레 Caenorhabditis 엘레간스는 transgenically 인간 β - 아밀로이드 펩타이드를 (Aβ) 표현하는 설계하실 수 있습니다. 의 Aβ의 유도 표현 C. 엘레간스 근육은 Aβ 독성을 조절 치료를 모니터링하는 데 사용할 수있는 신속하고 재현할 마비의 표현형로 ​​연결됩니다.

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Circadian 리듬을 연구 및 매개 변수 잠을 전위의 활동 시금 Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

연구

신경과학

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans 추적 및 행동 측정

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...