Мы описываем сбор стволовых клеток дыхательных путей из слизистой оболочки носа. Эти клетки расширяются и дифференцируются в псевдостратифицированный эпителий в лаборатории. Это расширение и дифференцировка in vitro, которая похожа на наши дыхательные пути in vivo, что означает, что существуют специализированные клетки, такие как реснитчатые клетки, которые можно использовать для количественной оценки частоты биения ресничек.
Чтобы обеспечить последовательную и воспроизводимую количественную оценку частоты биения ресничек между различными людьми и в ответ на различные препараты, мы стандартизируем условия культивирования и получение изображений. Измерения частоты биения ресничек используются в качестве клинических инструментов при таких заболеваниях, как первичная цилиарная дискинезия. Мы надеемся установить это как клинический маркер муковисцидоза.
Эту процедуру демонстрируют Кейтлин Аллан и Лора Фосетт, аспиранты из моей лаборатории, и доктор Шэрон Вонг, постдок из моей лаборатории. Начните с того, что попросите участника дышать ртом. Затем, взяв цитологическую кисть в доминирующей руке и положив пятую цифру на подбородок участника, чтобы закрепить руку, вставьте цитологическую кисть в носовой проход участника под углом 45 градусов к лицу участника и проведите ее через носовой мяс.
После поворота щетки в вертикальном положении, чтобы она была перпендикулярна лицу участника, осторожно, но твердо, подвиньте кисть к боковой стенке носа под нижней носовой раковиной, пока она не окажется в средней и задней части нижней носовой части. Поверните кисть на 360 градусов до трех раз. Затем аккуратно удалите его, обратив вспять маневр вставки, чтобы клетки не смещались с кисти.
Поместите кисть в подготовленную коллекционную трубку со средой для сбора носовых клеток и поместите сборную трубку на лед. После мягкого вихря, чтобы выбить клетки из щетки, перенесите сборную трубку на льду обратно в шкаф биобезопасности. Используя серологическую пипетку, перенесите среду из коллекционной трубки в новую трубку, оставив после себя цитологические щетки.
Затем центрифугируйте образец. После центрифугирования повторно суспендируют клеточную гранулу в одном миллилитре условного перепрограммирования клеточной среды. Затем, используя пятимиллилитровую серологическую пипетку, пропустите клетки через клеточное сито, помещенное поверх 50-миллилитровой трубки круговыми движениями.
Чтобы получить одноклеточную суспензию, соберите суспензию со дна трубки и пропустите ее через сито несколько раз. Затем выбросьте клеточное сито. Чтобы засеять эпителиальные клетки дыхательных путей на подготовленные проницаемые опорные вставки, хорошо перемешайте клетки, не создавая пузырьков, гарантируя, что они однородны и находятся во взвешенном состоянии.
Затем добавляют 150 микролитров клеточной суспензии на апикальную сторону подготовленных проницаемых опорных вставок. Чтобы дифференцировать эпителиальные клетки дыхательных путей на границе раздела воздух-жидкость, культивируйте их в дифференцировке или среде ALI в течение двух дней. Затем аспирируйте среду и добавьте 750 микролитров среды ALI только в базальный отсек для создания воздушно-жидкостного интерфейса.
Чтобы засеять эпителиальные клетки дыхательных путей в куполах ECM, повторно суспендировать диссоциированные эпителиальные клетки дыхательных путей с соответствующим объемом 90% ECM. Затем, удерживая пипетку вертикально под углом 90 градусов как можно ближе к дну колодца, дозируйте 50 микролитров суспензии ячейки ECM к центру лунки. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут, пока ECM не затвердеет.
В то время как ECM затвердевает, нагрейте органоидную среду для посева дыхательных путей или AOSM до комнатной температуры, чтобы предотвратить ее повторное сжижение и распад купола ECM при добавлении. После инкубации добавьте 500 микролитров подогретого AOSM в каждый колодец, раздав его по стенке. Не наносите пипетку непосредственно на купол ECM.
Меняйте носитель каждые два дня в течение четырех-семи дней. Чтобы аспирировать среду, наклоните пластину под углом 45 градусов и аспирируйте от нижнего края колодца подальше от купола ECM. Через четыре-семь дней инициируйте дифференцировку органоидов, добавляя 500 микролитров подогретой органоидной дифференцировки дыхательных путей, или AODM, в каждую лунку, и меняйте среду каждые два дня в течение семи дней.
Поместите культуральную пластину, содержащую модели эпителиальных клеток дыхательных путей, во вставку пластины микроскопа и закройте камеру окружающей среды микроскопа. Дайте образцу уравновеситься в предварительно нагретой, 37 градусов по Цельсию, 5% заполненной углекислым газом камере микроскопа в течение 30 минут. В окуляре микроскопа сосредоточьтесь на модели клетки.
Затем, используя программное обеспечение для сбора данных, нажмите L100, чтобы переключить световой путь к порту, где установлена камера. Нажмите зеленую кнопку «Воспроизвести», чтобы визуализировать поле зрения микроскопа с помощью программного обеспечения. Убедитесь, что реснички находятся в фокусе, и при необходимости отрегулируйте.
Чтобы получить покадровые изображения из меню, нажмите «Получить», а затем «Fast TimeLapse». Во всплывающем окне выберите место сохранения и имя файла, получите 1 000 кадров. Чтобы просмотреть реснички в поле зрения микроскопа, нажмите «Применить», а затем зеленую кнопку «Воспроизвести».
При необходимости отрегулируйте Z-фокус. Затем нажмите кнопку Выполнить сейчас, чтобы записать Fast TimeLapse. После установки необходимого программного обеспечения и наборов инструментов скопируйте соответствующие пользовательские сценарии анализа и папку сценариев поддержки на локальный диск компьютера.
Затем, после компьютерного программного обеспечения, нажмите на вкладку «Главная», а затем «Установить путь». Во всплывающем окне нажмите Добавить с вложенными папками. Под путем поиска MATLAB выберите отображаемую папку.
Затем нажмите «Сохранить и закрыть». Убедитесь, что сценарии анализа связаны с вычислительным программным обеспечением, проверив, что они отображаются на левой панели. Затем перенесите пример необработанных файлов образов, полученных на локальный диск компьютера.
Затем нажмите на BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m файл скрипта анализа в вычислительном программном обеспечении. Чтобы запустить скрипт, нажмите на вкладку Редактор, а затем зеленую кнопку Play.
В появившемся окне приглашения выберите необработанные файлы изображений для анализа. Введите время экспозиции для времени получения за кадр. Затем нажмите OK. Запустите объект GetFirstAmplitude.
m скрипт в папке, содержащей файлы AveSpectrum. Подождите, пока сценарий выведет FirstAmplitudeStacked. xlsx файл, который содержит наибольшую амплитудную частоту и находится в физиологическом диапазоне биения эпителиальных ресничек дыхательных путей.
Скопируйте значения частоты из firstAmplitudeStacked. xlsx, и построить их с помощью программного обеспечения для научного анализа. Представлены результаты частоты биения ресничек, измеренных в моделях ALI эпителиальных клеток дыхательных путей, полученных от трех участников с муковисцидозом и трех здоровых контрольных участников.
На 14-й день дифференциации культуры присутствовали биение ресничек. С 14-го, 21-го дня дифференциации культуры статистически значимого увеличения частоты биения ресничек между когортами не наблюдалось. На 21-й день дифференциации культуры средняя частота биения ресничек у здоровых контрольных участников была значительно выше, чем у участников с муковисцидозом.
Кроме того, когда частота биения ресничек была изображена в тех же клеточных моделях после удаления слизи, наблюдалось статистически значимое увеличение частоты биения ресничек при удалении слизи в моделях ALI как здоровых людей, так и людей с муковисцидозом. Среда визуализации должна строго регулироваться, так как функция ресничек чрезвычайно восприимчива к изменениям факторов окружающей среды. Эта платформа может быть создана для скрининга конкретных лекарств пациента, чтобы иметь возможность идентифицировать препараты, которые модулируют функцию CFTR.
