유선은 매우 역동적이며 평생 동안 여러 차례의 리모델링을 거칩니다. 우리의 프로토콜은 건강하고 병든 유선에서 조직 재배열을 유도하는 세포 역학을 포착 할 수있게합니다. 교체 가능한 뚜껑이 있는 당사의 유방 이미징 창은 최대 몇 주까지 장기간에 걸쳐 유선의 종방향 생체 내 이미징을 수행할 수 있습니다.
유방 이미징 창의 교체 가능한 뚜껑은 항상 최적의 이미징 조건을 보장하고 이미징 세션 사이에 조직 조작 또는 약물 투여를 허용합니다. 우리의 방법은 건강한 유선 생물학에 대한 통찰력을 제공 할뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 유방 종양 개시 및 진행을 연구 할 수있게합니다. 유방 이미징 창의 뚜껑을 멸균 표면에 놓고 전체 림 뚜껑 둘레에 시아 노 아크릴레이트 접착제를 적용하여 시작하십시오.
뚜껑 위에 조심스럽게 10mm 둥근 유리 커버 슬립을 놓습니다. 멸균 된 나무 스틱을 사용하여 유리 커버 슬립을 배치하고 아래로 밀어 내려 유리 커버 슬립과 뚜껑의 프레임 사이에 밀폐 된 씰을 보장합니다. 유리가 뚜껑의 팔에있는 구멍을 덮지 않도록하십시오.
뚜껑과 유방 이미징 창을 닫힌 페트리 접시에 적어도 30 분 동안 80 % 에탄올에 담그고 소독하십시오. 아세톤에 담근 면봉을 사용하여 유리 커버 슬립에 과량의 시아노아크릴레이트 접착제를 제거합니다. 수술을 위해 마우스를 준비하려면 면도날을 사용하여 네 번째 유선의 주변 영역을 면도하십시오.
네 번째 젖꼭지를 랜드 마크로 사용하고 끈적 끈적한 테이프를 사용하여 느슨한 머리카락을 제거하십시오. 발 금단 검사를 수행하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 미세한 Graefe 포셉을 사용하여 피부를 부드럽게 들어 올리고 작은 스프링 가위를 사용하여 네 번째 유방 지방 패드 위에 피부에 10 ~ 15 밀리미터 대각선 절개를 만들고 네 번째 젖꼭지를 방향점으로 사용하고 복막 또는 유선을 자르거나 손상시키지 않도록하십시오.
유방 지방 패드와 하부 조직층으로부터 피부를 분리하여 절개 라인 주위에 최대 다섯 ~ 여덟 밀리미터의 무딘 해부를 사용하여 유방 이미징 창틀에 맞는 포켓을 만듭니다. 림프절 또는 종양 병변의 위치를 포함하는 유방 조직의 거시적 특징에 기초하여 관심 영역 또는 ROI를 정의한다. 절개와 관련하여 ROI를 중심에 두십시오.
멸균 포셉을 사용하여 유방 이미징 창을 들고 절개가 창을 삽입하기에 충분히 큰지 테스트하십시오. 필요한 경우 유방 이미징 창이 들어갈 때까지 절개를 약간 확대하십시오. 창문을 제거하고 5-0 실크 봉합사를 사용하여 꼬리 끝에서 시작하여 피부 외부에서 안쪽으로 절개 가장자리에서 한 두 밀리미터 떨어진 곳에 지갑 끈 봉합사를 놓습니다.
절개를 따라 약 다섯 밀리미터 위로 움직이고 봉합사 실을 내부에서 외부로 피부를 통과시킵니다. 절개의 가장자리를 따라이 절차를 반복하여 다섯 개에서 여섯 개의 루프로 구성된 원형 봉합사를 만듭니다. 봉합사 실의 최종 출구는 첫 번째 입구에서 약 두 ~ 다섯 밀리미터 떨어진 곳에 위치해야합니다.
유방 이미징 창을 절개 안쪽에 맞추고 Graefe 포셉을 사용하여 조심스럽게 피부를 창문의 홈에 놓습니다. 봉합사의 루프를 바깥에 두십시오. 지갑 끈 봉합사의 루프를 당기고 봉합사의 양쪽 끝을 부드럽게 당겨 유방 이미징 창의 홈에서 조이십시오.
외과 용 매듭으로 묶고 과도한 실을 잘라냅니다. 이쑤시개를 사용하여 석유 젤리를 창문의 안쪽 테두리에 바르면 기본 조직을 피할 수 있습니다. 멸균 포셉으로 창 프레임을 아래쪽으로 부드럽게 밀고 뚜껑을 창틀에 놓습니다.
이렇게하면 유선과 유방 이미징 창 뚜껑 사이에 공기가 많이 들어 있지 않습니다. 얇은 포셉의 끝을 뚜껑의 팔에있는 구멍을 통해 놓고 시계 방향으로 비틀어 뚜껑을 조이십시오. 뚜껑을 조인 후에도 약간의 공기가 남아 있으면 피부를 통해 멸균 인슐린 바늘을 유방 조직과 뚜껑 사이의 구멍으로 도입하고 플런저를 천천히 꺼내어 유선과 유방 이미징 창 뚜껑 사이에 진공을 만듭니다.
이제이 절차 후에 림프절을 쉽게 관찰 할 수 있습니다. 봉합사의 안정성 또는 뚜껑의 잠재적 손상을 포함하여 유방 이미징 창 프레임과 뚜껑의 상태를 검사하십시오. 유방 이미징 창이 이미징 박스 인레이의 구멍에 떨어지는 방식으로 마우스를 인레이에 놓습니다.
반투명 및 종이 테이프를 마우스 뒷면에 발라서 마우스를 안정시키고 호흡으로 인한 조직 움직임을 줄입니다. 세 시간 이상의 이미징 세션의 경우, 유연한 바늘을 마우스 목에 피하 상태로 놓고 종이 테이프로 고정하십시오. 영양 믹스가 있는 10밀리미터 주사기를 유연한 실리콘 튜브에 부착하고 튜브 끝에 도달할 때까지 영양소 믹스를 밀어 넣습니다.
실리콘 튜브를 유연한 바늘에 연결하고 30 분마다 주입 된 용액 50 마이크로 리터를 주입하십시오. 이미징 박스 위에 뚜껑을 올려 닫습니다. 그런 다음 이미징 박스를 현미경 단계에 고정하십시오.
마우스가 이미징 박스 내부에서 안정되어 있는지 확인합니다. 현미경의 epifluorescence 모드를 사용하여 관심 영역을 정의하고 현미경 설정을 적용합니다. 이미징 소프트웨어 네비게이터 모드에서 나선형 기능을 사용하여 큰 개요 타일 스캔을 생성하고 조직의 참조 맵을 만듭니다.
나선형 개요 내에서 관심 영역을 정의한 다음 위쪽 및 아래쪽 Z 평면을 정의하여 Z 스택을 결정합니다. 시작을 눌러 조직의 자세한 입체 또는 사차원 Z 스택을 가져옵니다. 얇은 포셉의 끝을 뚜껑의 팔에있는 유방 이미징 창 구멍을 통해 놓고 시계 반대 방향으로 비틀어 뚜껑을 느슨하게하십시오.
대안적으로, 조직은 특정 관심 영역에 대한 이미징 조건을 최적화하기 위해 멸균 둔탁 포셉을 사용하여 조작되거나 재배치될 수 있다. 유방 이미징 창의 내부 테두리에 석유 젤리를 바르고 기본 조직을 피하십시오. 멸균 포셉으로 창 프레임을 아래쪽으로 부드럽게 밀고 뚜껑을 창틀에 놓습니다.
마지막으로, 얇은 포셉의 끝을 뚜껑의 팔 구멍을 통해 놓고 시계 방향으로 비틀어 뚜껑을 밝게하십시오. 사춘기 Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-막 토마토-막 GFP 마우스에 저용량의 타목시펜을 주사하여, Rosa26-막 토마토-막 GFP 대립유전자의 Cre-매개된 재조합을 유도하였다. 마우스를 발달하는 유선의 역동적인 변화를 따르기 위해 첫째, 셋, 다섯 날에 영상화하였다.
대표적인 이미지는 유방 이미징 창을 통해 이미지화 된 여러 날에 걸쳐 길쭉하고 분기되는 유방 덕트의 3D 렌더링을 보여줍니다. 분기 팁과 길쭉한 분기의 단일 Z면 이미지가 여기에 표시됩니다. 스트로마의 단일 세포는 흰색 별표로 강조 표시됩니다.
대표적인 이미지는 유방 영상 창을 통해 영상화된 마우스의 사타구니 림프절을 보여준다. 두 번째 고조파 세대는 녹색으로 묘사됩니다. 수일에 걸친 성인 여성 E-cadherin 막 CFP 마우스의 유방관 구조의 3D 렌더링된 이미지가 여기에 도시되어 있다.
콜라겐 I 패턴은 동일한 ROI를 되짚어내기 위해 사용되었고, E-cadherin 막 CFP 신호는 덕트 세포를 표시하기 위해 사용되었다. 키쿠메 녹색-적색 마우스는 보라색 빛에 노출되기 전과 후에 제로일에 영상화되었다. 이미징 세션은 변환 후 둘째, 여섯 및 10 일에 반복되었습니다.
유선의 동일한 영역을 10 일 동안 유방 이미징 창을 통해 이미징했습니다. 더 작은 영역은 0일째에 광변환되었고, 시간에 따른 키쿠메 적색 신호의 유사한 희석률을 나타냈으며, 이는 상피 전체에 걸쳐 동일한 회전율을 나타낸다. 표시된 영역의 확대/축소 이미지는 광변환 후 6일 및 10일 후에 세포 수준에서 증식성 이질성을 보여준다.
광변환 10일 후 상이한 세포의 적색 대 녹색 비율의 정량화는 동일한 덕트 미세환경 내의 일부 세포의 고도로 가변적인 희석 속도를 나타냈다. 이 절차의 중요한 단계는 이미징 세션 사이에 뚜껑을 여는 것입니다. 창의이 독특한 특징은 이미징 조건을 개선하고 조직의 종방향 이미징을 허용합니다.
교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창은 마우스 유선에서의 종양 개시 및 진행 분야에서 생체 내, 빠른 작용 약물 검사 및 스크리닝에 관한 새로운 질문을 용이하게합니다.
