Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

시작하려면 면도하고 마취된 쥐를 보온 패드에 놓습니다. 네 번째 젖꼭지 부근의 핀셋으로 피부를 끼우고 돌출 된 피부를 날카로운 가위로 잘라 정중선을 약 1cm 정도 절개합니다. 분비샘 주위를 두개골과 꼬리 방향으로 원을 그리며 절개하고 복부에서 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다.

생리식염수로 외인성 혈액을 즉시 제거하여 이후에 광학 해상도가 손실되는 것을 방지합니다. 출혈을 최소화하려면 휴대용 소작기로 눈에 띄는 혈관을 밀봉하십시오. 그런 다음 미세한 집게로 표층을 부드럽게 두드려 표재성 결합 조직과 지방 조직을 제거합니다.

노출된 분비샘을 생리식염수로 촉촉하게 유지하십시오. 필요한 경우 수술 중에 노출된 분비샘을 목욕시켜 약리학적 제제 또는 세포 기관 특이적 염료와 같은 외인성 제제로 분비샘을 치료합니다. 반투명하고 유연한 열가소성 필름으로 복벽을 보호하십시오.

복부가 아래로 향하게 하여 마우스를 역현미경 s에 조심스럽게 놓습니다.tage 피부 덮개가 중앙 커버 유리 위로 확장되도록 합니다. 얇은 젤 층으로 노출 된 부분을 보호하십시오. 뒷다리와 꼬리를 스테이지에 테이프로 붙입니다.

그런 다음 피부 덮개와 신체 벽 사이에 3개의 테이프로 감긴 면 막대기로 준비한 맞춤형 노치 스페이서를 놓아 호흡과 심장 박동으로 인한 움직임 인공물로부터 분비샘을 완충합니다. s의 양쪽 끝에 플라스틱 덮개를 단단히 테이프로 붙입니다.tage 이미징 중에 피부 플랩이 미끄러지는 것을 방지하기 위해 개구부. 튜브, 주사기 및 펌프에 연결된 등쪽 피부 아래에 피하 유치 카테터를 삽입합니다.

기존의 형광 현미경을 사용하여 피부 피판이 적절한 혈류로 안정적인지 확인합니다. BODIPY 665676로 라벨링된 EGFP 세포 또는 EGFP 멤브레인 마우스의 기존 컨포칼 현미경 검사와 모노단실펜탄으로 라벨링된 EGFP 멤브레인 마우스와 모노단실펜탄으로 라벨링된 tdTomato 멤브레인 마우스의 2광자 현미경을 수행합니다. EGFP cyto 마우스에서, 분비 상피 세포의 세포질은 EGFP에 의해 뚜렷하게 표지되었습니다.

동시에 BODIPY 665676로 염색된 지질 방울은 특히 정점 표면 쪽으로 둥근 형광체로 나타났습니다. 타임랩스 분석은 BODIPY 665676 염색된 지질 방울이 다양한 속도로 기저부에서 정점 영역으로 이동하고 운송 중에 서로 융합하는 것을 보여주었습니다. EGFP 멤브레인 마우스에서 EGFP는 모세혈관 및 분비 상피 세포의 원형질막을 강조했으며 BODIPY 염색 지질 방울이 세포질 전체에서 볼 수 있었습니다.

EGFP 멤브레인 또는 tdTomato 멤브레인 마우스의 유선에 대한 2광자 현미경 검사를 통해 유선 형태에 대한 보다 포괄적인 조사가 가능했습니다. 표면의 콜라겐 섬유는 2차 고조파 생성을 통해 monodansylpentane 채널에서 시각화됩니다. 실질로 더 들어가면 분비 상피는 기저, 측면 및 정점 원형질막과 monodansylpentane 염색 지질 방울로 드러납니다.

중앙 내강은 폐포 쪽으로 더 분명해집니다. 빨간색 tdTomato fluorophore는 EGFP cyto 마우스의 EGFP와 달리 모세관 내피를 라벨링하는 데 특히 유용했습니다.