실리콘 창문을 주조 및 삽입하는이 절차는 종방향 생체 내 이미징에 대한 기술적 장벽을 낮 춥니 다. 우리의 프로토콜은 동물에 의해 잘 견딜 수있는 튼튼하고 쉽게 적응할 수있는 창문을 생산합니다. 이 기술을 사용하여 간, 췌장 및 유선의 암과 면역 세포를 이미지화했습니다.
최소한의 조정으로 많은 해부학 적 위치와 생물학적 질문에 적응할 수 있습니다. 처음으로이 기술을 시도하는 사람들은 주사기에서 소량의 접착제를 방출하는 연습을하십시오. 접착제를 너무 많이 바르면 이미징 필드가 흐려지고 수술 영역이 작업하기가 어려워집니다.
PDMS의 갓 제조된 실리콘 폴리머인 폴리디메틸실록산을 소량의 실리콘 폴리머를 깨끗한 매끄러운 표면 상에 증착하여 실리콘 윈도우를 캐스팅하기 시작하고, 부피 대 면적비를 조정하여 원하는 두께를 얻는다. PDMS가 원하는 주조 표면에 증착되면 스테인레스 스틸 그리드를 실리콘으로 가볍게 눌러 동일한 조직 영역의 반복 이미징을위한 랜드 마크를 제공합니다. 기포를 제거하고 실리콘 폴리머를 탈기시키려면 코팅된 표면을 진공 데시케이터에 45분 동안 두십시오.
완료되면 중합체를 섭씨 75 ~ 80도의 오븐에서 45 분 동안 경화시킵니다. 금형의 가장자리에 폴리머를 스코어링하고 포셉을 사용하여 주조에 사용되는 표면에서 경화 된 창을 부드럽게 벗겨냅니다. 마우스를 왼쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.
면도된 수술 부위에 10% 부피의 포비돈 요오드 용액과 70 부피% 부피의 에탄올을 세 번 연속으로 도포하여 수술을 위해 마취된 마우스를 준비한다. 멸균 수술 현장을 유지하기 위해주의를 기울여야합니다. 그런 다음 멸균 가위와 포셉을 사용하여 늑골 아치 아래 3 밀리미터에서 오른쪽 측면을 10 밀리미터 절개하십시오.
피부의 한 평방 센티미터 부분을 제거하고 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 피부 부분보다 약간 작은 복막 부분을 제거하십시오. 소량의 외과 용 접착제를 멸균 된 웰 플레이트에 놓고 31 게이지 주사기로 꺼내어 이미징 할 부위의 가장자리 주위의 간 표면에 적용한 다음 원하는 부위에 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 약 2 분 동안 간을 단단히 고정하십시오. 복막 아래에있는 창문의 가장자리를 접은 후 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 떨어 뜨린 후 포셉으로 복막을 눌러 창문에 고정시킵니다.
마찬가지로, 피부를 밀어 내리기 전에 소량의 외과 용 접착제를 증착하여 복막을 밀봉 한 다음 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라지 못하게하는 림을 만듭니다. 창을 췌장에 삽입하려면 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓고 앞에서 설명한 것처럼 복막의 섹션을 제거하기 전에 왼쪽 측면을 절개하십시오. 멸균 식염수에 담근 멸균 면봉을 사용하여 비장을 부드럽게 당겨 췌장을 시각화했습니다.
축축한 면봉으로 췌장을 재배치하여 절개를 통해 더 많은 표면적을 볼 수 있도록하십시오. 췌장에 접근하면 앞에서 설명한대로 원하는 부위에 이미징 창을 삽입하고 밀봉하십시오. 유선에 접근하려면 마우스를 수핀 위치에 놓고 멸균 가위와 포셉을 사용하여 사타구니 젖꼭지 중 하나에 10 밀리미터 절개 내측을 만듭니다.
유선의 위 피부의 0.5 평방 센티미터 부분을 제거한 다음 두 표면 사이에 멸균 가위를 퍼뜨려 피부에서 유선을 부드럽게 분리하여 부착을 방해합니다. 31 게이지 주사기를 사용하여 영상화 할 부위의 가장자리 주위의 유선의 표면에 소량의 외과 용 접착제를 바르십시오. 접착제가 건조 될 때까지 유선에 창문을 단단히 대고 고정하십시오.
창 가장자리를 피부 아래로 접은 후 현재 피부 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 놓고 포셉으로 피부를 아래로 밀어 넣어 피부를 창문에 고정시킵니다. 창 가장자리 주위에 접착제를 적용하여 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 림을 만듭니다. 이미징 세션을 시작하기 전에 70% 에탄올에 담근 면봉으로 창문을 부드럽게 닦아 잔류 이물질로부터 창문을 청소합니다.
침수 렌즈를 사용할 때는 거품을 피하면서 창문에 초음파 젤을 바르십시오. 이미징을 시작하려면 안구를 통해 초점이 맞춰진 격자를 찾아 배치합니다. 그런 다음 그리드의 바닥을 0으로 설정하여 대략적인 조직 이미징 깊이를 결정합니다.
이 정보는 후속 이미징 세션에서 해당 Z-평면을 찾는 데 도움이됩니다. 여러 이미징 세션에서 동일한 위치를 식별하려면 그리드의 사각형을 참조점으로 활용합니다. 이미징 세션 중에 격자 방향과 격자 내에서 이미지화된 각 시야각의 위치를 기록해 둡니다.
그리드는 이미징 세션의 성공에서 특정 그리드 영역 및 이미징 필드로 다시 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 각 이미징 세션에 이어 70% 에탄올에 담근 면봉으로 창문을 부드럽게 닦아내어 잔류 렌즈 침지 매체와 이물질을 제거한다. 실리콘 창은 시간이 지남에 따라 동적 면역 세포 침윤을 포착 할 수 있습니다.
대표적인 분석은 이틀째 및 넷째 날에 리모델링된 유선조직 내의 호중구 침윤을 예시한다. 실리콘 창을 사용하면 창 삽입 후 몇 주 동안 여러 시점에서 종양을 시각화 할 수 있습니다. 200 밀리그램의 PDMS로 주조 된 창문은 일반적으로 150 밀리그램의 창문 캐스트보다 훨씬 큰 인성을 나타 냈기 때문에 외과 적 이식에 더 좋습니다.
참고로, PDMS 창은 표준 유리만큼 단단하지 않았으며, 유리 창의 영 모듈러스가 PDMS보다 훨씬 컸습니다. 다른 장기에서의 창 삽입은 대부분의 마우스가 시간이 지남에 따라 체중이 계속 증가함에 따라 잘 견뎌 냈습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 접착제를 사용하여 창을 완전히 봉인하는 것입니다.
이것은 감염, 조직이 건조되는 것, 창문의 변위를 방지합니다. 시술 후 실리콘 창을 통해 동형 외과 주사를 할 수 있으므로 연구원은 세포 증식, 세포 - 세포 상호 작용 및 치료 효능과 같은 다양한 주제를 연구 할 수 있습니다.
