형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

이 방법은 글리코겐 입자의 구조 조직에 대한 더 나은 이해를 제공한다. 글루칸 사슬의 집단, 소위 사슬 길이 분포가 글리코겐 입자의 물리적 화학적 특성을 결정하기 때문에 중요한 문제입니다. 물 용해도와 같은.

이 기술의 한 가지 주요 장점은 형광이 글루칸 사슬 길이에 관계없이 일정하다는 것입니다. 글루칸에 의해 결합된 APTS 분자는 단 하나뿐이다. 따라서, 형광 강도는 글루칸 사슬의 수에 직접적으로 비례한다.

보조 모세관 전기영동 분야는 글리코겐 대사 효소의 의학적 메카니즘을 해결하는 데 적합합니다. 예를 들어, 우리는 효소를 분지화하여 허용 된 글루칸 위로 옮기는 글루칸 사슬의 중합 정도를 결정할 수 있습니다. 반응은 조건에서 수행되어야 한다.

따라서 지역은 습기로부터 보호되어야합니다. 정제된 글리코겐 밀리리터당 0.5-2밀리그램 200마이크로리터를 pH 4.8의 100 아세테이트 완충액 200마이크로리터와 혼합한다. 이소아밀라아제 2 마이크로 리터와 풀루라제 1.5 마이크로 리터를 첨가하십시오.

위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞으십시오. 그런 다음 섭씨 42도에서 1.5 밀리리터 튜브에서 16 시간 동안 배양하십시오. 섭씨 95도에서 5분 동안 인큐베이션하여 반응을 중지시킨다.

16에서 원심분리하고, 실온에서 5분 동안 100회 G' 펠릿화하여 불용성 물질을 제거하였다. 피펫으로 수퍼 유지 보수를 제거하고 주석이 달린 새로운 튜브로 옮깁니다. 수지 비드를 빈 마이크로 퍼지 튜브에 첨가한 후, 음이온 양이온 교환 수지 비드 100 마이크로리터의 당량을 첨가하여 상층액을 탈염시키고 교반한다.

피펫팅으로 샘플을 수집하고 새로운 주석이 달린 튜브에 놓습니다. 샘플을 동결 건조하십시오. 건조된 샘플을 실온 또는 섭씨 20도에 보관하십시오.

건조된 샘플을 2 마이크로리터의 1몰 소듐 시아노보로하이드라이드 및 테트라히드로푸란, 및 2 마이크로리터의 8 아미노 1-3-6 피렌 트리술폰산과 혼합한다. 어둠 속에서 섭씨 42도에서 16 시간 동안 배양하십시오. 46 마이크로 리터의 초순수를 각 샘플에 첨가하십시오.

샘플을 50 번 희석하려면 100 마이크로 리터의 초순수 49 마이크로 리터에 샘플 1 마이크로 리터를 추가하십시오. 소용돌이에서 철저히 혼합하십시오. 얼굴을 설정하는 동안 샘플을 5 ~ 10 분 동안 어둠 속에 두십시오.

역극성 전기 영동을 수행하려면 방법을 설정하고 사출 압력을 평방 인치당 0.5 파운드 힘으로 설정하십시오. 그런 다음 분리를 위해 극성을 역방향 모드로 설정하십시오. N-연결된 탄수화물 분리 완충액을 초순수에서 삼분의 일로 희석하십시오.

APTS 라벨링된 글루칸 분리를 베어 용융 실리카 모세관에서 30 킬로볼트로 희석된 완충액에서 수행한다. 그런 다음 주입 시간을 설정하고 분석을 시작하십시오. 일렉트로페로그램 프로파일과 통합 데이터를 각각 포함하는 ASC 및 CDF 파일을 내보냅니다.

ASC 파일을 열고 시간 차트에 따라 상대 형광 단위를 그립니다. CDF 파일을 엽니다. 첫 번째 자동 통합을 진행하고 계곡을 사용하여 다음 매개 변수를 계곡 통합 및 최소 영역으로 조정하십시오.

부적절한 통합 이벤트를 수동으로 확인하고 수정하십시오. 4.13분에서 4.67분 사이에 관찰된 형광 신호는 미반응 APTS로부터 유래하였다. 표지된 말토헥사오스 DP 6의 알류티안 시간은 8.49분으로 추정되었다.

소 글리코겐의 글루칸 표지된 APTS는 DP 6의 알류티아 시간에 기초하여 확인되었다. 글리코겐이 탈분기 효소와 함께 배양되지 않은 대조 샘플에서 유리 말토올리고당의 흔적이 검출되지 않았다. 인셋 패널은 최대 44DP의 글루칸 사슬의 분리를 보여줍니다. 사슬 길이 분포는 각 DP에 대한 DP의 백분율로 도시된다. 평균 사슬 길이는 각각의 백분율 사슬 시간을 상응하는 중합 정도를 합산하여 계산하였다.

얼굴 분석에 따르면 가장 풍부한 글루칸은 말토스와 토끼 간, 굴의 말토 헥사 오스, 소 간에서 말토헵타오스입니다. 야생형 및 돌연변이 시아노박테리아 박테리아 균주로부터 정제된 글리코겐의 사슬 길이 분포를 얼굴 분석을 사용하여 결정하였다. 감산 분석은 돌연변이체의 각 DP의 퍼센트에서 야생형의 각 DP의 퍼센트를 뺀 것으로 수행되었다.

야생형 및 시네코시스티스의 돌연변이체로부터의 글리코겐의 평균 사슬 길이 분포를 각 CLD에 대해 관찰된 최대 피크에 따라 정규화하였다. 이 기술은 글리코겐 대사의 결함, 특히 안데르센 병 질환과 관련된 인간 질병에 대한 더 나은 이해를 가능하게하며, 세포에 비정상적인 글리코겐 입자가 축적되어 풍부한 결과를 초래합니다.