이 프로토콜은 구조를 보존하고 손실된 작은 글리코겐 입자의 양을 제한하는 방식으로 간 글리코겐 분자를 추출할 수 있습니다. 당뇨병이 글리코겐 구조를 변화시킨다는 것을 보여주는 이전 연구와 더불어, 이 방법은 당뇨병과 각종 글리코겐 저장 질병에 학문에서 제공할 수 있었습니다. 간에서 글리코겐을 추출하려면 먼저 냉동 간 조직 1g을 글리코겐 분리 완충액 6mL가 들어 있는 15mL 튜브에 옮깁니다.
얼음 위에 보관하면서 조직 균질화기를 사용하여 간 조직을 균질화합니다. 완료되면 셀 현탁액의 절반 또는 3 밀리리터를 새 튜브로 옮긴 다음 10 분 동안 끓입니다. 현탁액의 나머지 절반을 얼음 위에 두어 변성되지 않은 글리코겐 함유 관련 단백질을 추출합니다.
글리코겐 함량을 측정하기 위해 각 튜브에서 8마이크로리터 부분 표본을 제거하고 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 6, 000 G에서 잔여 현탁액을 회전시킨 후, 상층액을 초원심 분리기 튜브로 옮겨 5번째 G와 4 섭씨 온도에 3.6배 10에서 90분 동안 원심분리합니다. 나머지 상층액을 버린 후, 펠릿을 1.5 밀리리터의 글리코겐 분리 완충액에 재현탁시킨다.
그런 다음, 4 밀리리터 초원심 분리 튜브에 1.5 밀리리터의 30 % 자당 용액 이상의 샘플을 층화시킨 다음 2 시간 동안 앞에서 설명한대로 원심 분리합니다. 상층액을 버린 후 펠릿을 200마이크로리터의 탈이온수에 재현탁시킵니다. 세포 현탁액에서 글리코겐을 침전시키려면 800마이크로리터의 절대 에탄올을 세포 현탁액에 첨가하고 잘 혼합합니다.
그런 다음 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 최소 1시간 동안 보관하여 강수를 허용합니다. 일단 강수가 생기면, 6, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 표본을 분리하고 에타놀 강수 과정을 세 번 반복하기 위하여 탈이온수의 200 마이크로리터에 있는 글리코겐 펠릿을 재현탁하십시오. 글리코겐 함량 측정을 위해 각 튜브에서 8마이크로리터의 부분 표본을 최종 세포 현탁액에서 제거합니다.
그런 다음 나머지 상층액을 액체 질소에 얼리고 밤새 동결 건조합니다. 다음날 건조된 글리코겐 샘플을 섭씨 영하 20도의 냉동실에 보관합니다. 이 연구는 다양한 조건에서 추출한 건조 글리코겐 샘플의 순도, 조가공 수율 및 글리코겐 수율을 분석했습니다.
다양한 조건으로 추출한 그룹 간에 조수 수율과 글리코겐 수율에 유의한 차이가 없었습니다. 대조적으로, 글리코겐 순도는 슈크로스 농도 및 비등 단계의 첨가에 의해 현저하게 영향을 받았다. 가장 높은 순도의 글리코겐은 30% 슈크로스 농도 및 10분 비등 단계를 사용하여 추출하였다.
글리코겐은 최종 추출물의 분자 크기에 대한 다양한 조건의 영향을 평가하기 위해 끓이거나 끓이지 않은 30%50% 또는 72.5%sucrose에 의해 간 균질액으로부터 추출되었습니다. 사슬 길이 분석은 30%50% 및 72.5% 슈크로스 농도를 사용하여 끓인 간과 끓이지 않은 간 모두에 대해 6개의 간에서 수행되었습니다. 유체역학적 반경 RH가 30나노미터 미만인 글리코겐 분자 또는 베타 입자의 함량을 계산하였다.
끓인 샘플은 끓이지 않은 샘플보다 평균 RH 값이 낮고 입자 함량이 높았습니다. 또한, 낮은 슈크로스 농도는 더 낮은 RH 값과 더 높은 베타 입자 함량을 초래하였다. 비등 단계의 도입은 또한 RH 최대 또는 최대 값을 낮추는 반면, 슈크로스 농도는 큰 영향을 미치지 않았습니다.
조직이 완전히 균질화되고 조직 덩어리가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 따라서 이 기술은 더 작은 베타 입자를 서로 연결하여 더 큰 알파 입자를 형성하는 경로를 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.
