이 프로토콜은 스펙트럼 포커싱 SRS 현미경의 구현 및 최적화와 실시간 자극된 라만 조직학 애플리케이션에 어떻게 사용될 수 있는지를 시연할 것이다. 이 기술의 가장 큰 장점은 SRS가 조직 처리 및 염색을 필요로하지 않기 때문에 계측이 적절하게 정렬되면 샘플을 처리 할 수있는 속도입니다. 이 프로토콜은 조직학에만 국한되지 않고 다른 SRS 애플리케이션에도 적용 가능합니다.
이러한 적용에는 소분자, 약물, 세포 및 조직이 포함됩니다. 먼저 펌프 빔에 무채색 렌즈 한 쌍을 설치하여 레이저 빔 크기를 시작점으로 두 배로 확대하십시오. 100 밀리미터와 200 밀리미터 렌즈를 서로 약 300 밀리미터에 놓습니다.
그런 다음 펌프 빔을 두 렌즈의 중심을 통해 정렬하십시오. 다음으로 두 번째 렌즈 뒤에 거울을 놓아 빔을 두 미터 이상 떨어진 벽쪽으로 보냅니다. IR 카드로 거울에서 벽까지 빔을 추적하고 빔의 크기가 변하는지 확인하십시오.
빔의 크기가 거리의 함수로 변하는 경우 빔을 시준합니다. 조정을 위해 여러 스티어링 미러와 이색성 거울을 설치하여 두 개의 레이저 빔을 결합하십시오. 펌프와 스토크스의 공간 중첩을 최적화하여 한 미터 떨어진 두 개의 서로 다른 위치에서 이색성 거울 뒤의 빔을 모니터링합니다.
스티어링 미러 다음에 이색성 거울을 반복적으로 조정하여 Stokes 빔을 펌프 빔과 정렬합니다. 스캔 미러가 주차 위치에있을 때 한 쌍의 스티어링 미러를 조정하여 결합 된 빔이 레이저 스캐닝 현미경의 스캔 미러의 중앙으로 보내지는지 확인하십시오. 콘덴서 후에 초점 거리가 각각 100mm와 30mm인 다른 렌즈 쌍을 사용하여 전송된 빔을 광 다이오드에 릴레이하여 두 빔이 모두 광 다이오드 내에 포함되도록 합니다.
그런 다음 두 개의 저역 통과 필터를 설치하여 변조 된 Stokes 빔을 차단하십시오. 빔 샘플러를 스토크스 빔 경로에 배치하여 빔의 10%를 집어 들고 빠른 광 다이오드로 보내 80메가헤르츠 펄스 트레인을 감지합니다. 팬아웃 버퍼의 출력 중 하나를 가져와 대역 통과 필터로 필터링하여 20메가헤르츠 정현파를 얻습니다.
그런 다음 RF 감쇠기를 사용하여 출력 피크 전압을 약 500밀리볼트로 피크 전압으로 조정합니다. 결과 출력을 위상 시프터로 보내면 전압 소스로 RF 위상을 미세하게 조정할 수 있습니다. 이 출력을 RF 전력 증폭기로 보내고 증폭기의 출력을 EOM에 연결합니다.
Stokes 빔의 차단을 해제한 후 빔 경로에 광 다이오드를 배치하여 첫 번째 EOM의 변조 깊이를 최적화합니다. EOM 전압 및 쿼터 웨이브 플레이트를 변조 깊이가 만족스럽게 나타날 때까지 조정하십시오. 이색성 거울 뒤에 광 다이오드를 배치하여 레이저 빔을 감지합니다.
스토크스 빔을 먼저 차단한 다음 오실로스코프의 펌프 펄스 피크 중 하나를 확대합니다. 수직 커서를 배치하여 이 피크의 시간적 위치를 오실로스코프로 표시합니다. 이제 펌프 빔을 차단하고 스토크스 빔의 차단을 해제하십시오.
지연 단계를 변환하여 오실로스코프의 피크 위치를 이전 단계에서 표시된 위치와 일시적으로 일치시킵니다. 두 빔을 일치시키는 데 필요한 지연 거리를 계산하여 더 빠른 빔의 빔 경로를 길게하거나 느린 빔의 빔 경로를 단축시킵니다. 다음으로 DMSO 및 양면 테이프를 스페이서로서 사용하여 현미경 슬라이드 샘플을 준비하여 슬라이드와 커버슬립 사이에 샘플을 고정시킵니다.
커버슬립 면이 현미경 대물렌즈를 향하도록 현미경 위에 샘플을 놓고 밝은 장 조명 아래에서 I 조각의 샘플을 관찰합니다. 유리 테이프 인터페이스에서 기포의 상단 및 하단 레이어에서 샘플의 초점을 찾은 다음 테이프의 두 레이어 사이에 초점을 이동합니다. 다음으로 조정 가능한 빔 출력을 798나노미터로 설정합니다.
콘덴서의 광학 처리량에 따라 목표 초점에서 펌프 및 스토크스 빔에 대해 각각 약 40밀리와트로 광 전력을 조정합니다. 그런 다음 MATLAB에서 스캔 이미지를 열고 포커스라고 표시된 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다. galvo 스캐너 앞에 스티어링 미러를 조정하여 DC 신호를 채널 원 디스플레이에 중앙에 맞춥니다.
전동 지연 스테이지를 이동하고 채널 두 디스플레이에 표시된 잠금 출력을 면밀히 관찰하십시오. 마지막으로 AC 신호 강도를 최대화하기 위해 시간 지연을 조정합니다. 이색성 미러를 조정하여 SRS 신호를 AC 채널의 중앙에 맞춥니다.
그런 다음 잠금 증폭기의 위상을 조정하여 신호를 최대화하십시오. 샘플 슬라이드를 현미경에 장착하고 앞서 설명한 것처럼 샘플 초점에서 두 빔의 전력을 각각 약 40 밀리와트로 조정한 후. MATLAB에서 스캔 이미지를 엽니다.
그 후 DMSO의 2, 913 역센티미터 라만 피크에 대응하는 지연 스테이지를 통해 스캐닝하여 최대 SRS 신호를 찾는다. DMSO의 2, 913 역센티미터 라만 피크에 대응하는 SRS 이미지를 획득한다. ImageJ에서 이미지를 열고 프레임 중앙의 작은 영역을 선택합니다.
측정값 함수를 사용하여 선택한 영역에서 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 주파수 액세스 보정을 위해, DMSO의 2, 913 및 2, 994 역 센티미터 라만 피크를 커버하는 지연 스테이지 범위로 하이퍼스펙트럼 스캔을 저장하십시오. 그런 다음 하이퍼스펙트럼 데이터 세트에 해당하는 스테이지 위치를 저장합니다.
스테이지 위치에 대해 선형 회귀를 수행하고 라만 시프트를 2, 913 및 2, 994 역 센티미터로 이동합니다. 선형 회귀 방정식을 사용하여 지연 위치를 해당 라만 주파수로 변환합니다. 스펙트럼 분해능의 교정을 위해, 막대의 삽입으로 인해 증가된 광학 경로 길이로 이전 위치를 기준으로 스테이지 위치를 추정하십시오.
유리 막대가 추가될 때 빔의 약간의 편차로 인해 빔의 공간 중첩을 다시 정렬합니다. 편광 빔 스플리터, 쿼터 웨이브 플레이트 및 두 번째 EOM을 첫 번째 EOM 이후의 흡수 빔 경로에 설치합니다. 두 번째 EOM에 입력된 신호를 뽑은 다음 신호 입력을 첫 번째 EOM에 연결하고 전원을 켭니다.
첫 번째 EOM을 통해 빔을 전송하여 스토크스 빔을 20메가헤르츠로 변조합니다. 첫 번째 EOM의 기울기와 위치를 조정하여 빔이 EOM 크리스탈을 통해 중심이 되도록 합니다. 양면 테이프, 현미경 슬라이드 및 커버 유리로 조직 슬라이드 샘플을 준비하십시오.
시료를 현미경 표면에 놓고 커버슬립 면이 현미경 목표를 향하도록 합니다. 에피 모드 SRS 이미징의 경우, 빔이 현미경으로 들어가기 전에 반파 플레이트를 설치하여 현미경으로 들어가는 빔의 편광을 변경하십시오. 편광 빔 스플리터를 목표 위에 배치하여 탈분극된 후방 반사 빔이 검출기에 도달할 수 있도록 합니다.
다음으로, 75mm 아크로메이트 렌즈와 30mm 비구면 렌즈를 사용하여 물체의 뒤쪽 조리개에서 사진 검출기로 뒤쪽에 흩어져있는 광자를 릴레이하십시오. 검출기를 장착하여 편광 빔 스플리터에 의해 지시되는 후방 산란광을 수집한다. 그런 다음 필터를 설치하여 변조 된 빔이 검출기에 들어 가지 않도록하십시오.
막대 길이를 변경하면 스펙트럼 분해능에 영향을 미칩니다. 유리 짹짹 막대를 사용하지 않으면 DMSO의 두 라만 피크가 전혀 해결되지 않습니다. 유리 짹짹 막대의 수가 증가하면 만족스러운 지점에서 두 개의 피크가 해결되기 시작합니다.
정합된 처핑은 두 피크를 모두 해결하며 스테이지 위치를 주파수로 교정하는 데 사용할 수 있습니다. DMSO 스펙트럼을 이미지화하기 위해 사용되는 직교 편광의 두 시간 지연 펄스 트레인은 허용 가능한 변조 깊이와 시간적 분리를 갖는 SRS 여기 사이의 시간 지연을 보여준다. 대조적으로, 불량한 두 가지 컬러 SRS 위상 이동은 반전 또는 음의 피크를 발생시킨다.
생체외 마우스 뇌 조직의 2, 850 및 2, 930 역 센티미터에서의 실시간 2색 SRS 영상화가 여기에 도시되어 있다. 원시 지질 및 단백질 이미지는 지질 및 단백질 기여를 묘사하는 단일 이미지를 생성하도록 컬러 코딩되었다. 거짓 헤마톡실린 및 에오신 재착색은, 또한 병리학적 적용을 위해 헤마톡실린 및 에오신 염색을 모방하기 위해 수행되었다.
공간 시간 중첩 및 공간 분해능 최적화는 SRS의 공간 초점 접근 방식에서 가장 중요한 단계입니다. 이 방법은 일반적으로 과도 흡수 현미경과 같은 다른 펌프 프로브 현미경 실험에 적용 가능합니다. 이 방법은 또한 세포 및 조직에서 비형광 분자의 이미징을 허용한다.
여기에 제시된 방법은 클리닉에서 자극 된 라만 조직학의 향후 번역을위한 이미지 수집 시간을 단축시킵니다.
