This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer &#8216;Midwest Cancer Nanotechnology Training Center&#8217; Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.

아래에서 설명하는 프로토콜은 UIUC 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다. 1. 수집 및 수술 조직 샘플의 소화 <ol><li> 우측 결장 절제술 (도 1a 및도 1b) 후 종양 조직 샘플을 수집. 뿐만 아니라 인접한 건강한 사이트에서 조직을 수집합니다. </li><li> 12 ㎖의 HBSS를 함유하는 용액 15 ml의 유리 병에 즉시 조직을 옮긴다. 절연 거품 상자 안에 얼음에 병을 보관하십시오. </li><li> 45 분 내에서 추가 처리를 위해 조직 배양 후드로 조직 함유 바이알 전송. 후드 안쪽에 얼음 블록에 병을 보관하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 HBSS 용액을 6-7 ml의를 포함하는 6 웰 플레이트에 공급 조직을 따르십시오. 참고 : 물론 당 조직의 양이 헹굼 단계에서 중요하지 않습니다. </li><li> 얼음 블록에 6 웰 플레이트를 유지합니다. 두번 HBSS 용액 조직을 씻어. </li><li> 멸균 SCIS와 분리 된 섹션으로 깔끔하게 조직을 잘라SOR. 작은 부분으로 말하다 조직 멸균 메스 블레이드와 크기가 1-2mm 3보다 크지. </li><li> 조직을 전송하기 전에 (0.1 % 트립신 용액 1㎖를 함유) 표지 된 0.1 % 트립신 바이알을 단다. 피펫으로 0.1 % 트립신 튜브의 각으로 ~ 20 mg의 조직을 전송합니다. </li><li> 트립신의 추가 희석을 방지하기 위해 트립신 유리 병에 HBSS의 전송을 최소화하려고합니다. </li><li> 조직 전송 후 트립신 유리 병의 무게를 측정; 조직 덩어리와 같은 차이를 문서화. </li><li> ~ 20 mg의 조직과 24 웰 플레이트의 각 웰에 트립신 1 ml에 붓고. </li><li> 16 ~ 20 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 진탕 기에서 24 웰 플레이트를 넣습니다. 이 대기 기간 동안 또는 이전 시점에서, 폴리 아크릴 아마이드 겔 기판을 준비하고 3 장에 설명 된대로 ECM 단백질로를 기능화. </li></ol> 2. 효소 단일 세포 현탁액으로 조직 샘플의 해리와 ECM 기능화 탄성 Substrat에 배양 분리 된 세포ES 및 강성 폴리스티렌 요리 <ol><li> 진탕 기에서 4 ° C에서 잘 트립신에서 배양 16 ~ 20 시간 후, 피펫을 사용하여 (전체 성장 미디어의 2-3 ml를 포함) 4 ° C의 전체 성장 미디어 바이알에 4 ° C의 트립신에서 조직을 전송합니다. 성장 매체에 트립신의 최소한의 전송을 보장합니다. 주 : 완전 성장 배지 제형은 다음과 같다 : 10 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 전체의 1 %의 최종 농도 말 혈청이 보충 된 RPMI 1640 배지 기재. </li><li> 12-15 분 동안 37 ℃의 온수 배스에서 미디어 바이알을 함유하는 조직을 배치. </li><li> 피펫을 사용하여 HBSS 용액을 포함하는 15 ㎖의 유리 병에 조직을 전송, 부드럽게 흔들어. </li><li> 2.3를 반복합니다. </li><li> HBSS 용액 1 ml의 솔루션을 포함하는 유리 병 (HBSS)에 전달 0.1 %에 콜라겐 솔루션에서 조직을 제거합니다. 가습 세포 배양 인큐베이터에서 45 ° C에서 37 분, 5 % CO 2 환경 부화. 대기 시간, 따뜻한 growt 중15 ㎖ 중의 H 매체는 수조에서 37 ° C에서 바이알. </li><li> 피펫 최소화 콜라게나 이월에 모든 조직 조각을 잡아 당깁니다. 미리 예열 문화 매체 유리 병에 바로 조직 조각을 꺼냅니다. </li><li> 6 웰 플레이트의 각 웰에 40 μm의 잘 삽입 필터를 놓습니다. 1 ml의 세포 배양 매체를 사용하여 필터를 적셔. </li><li> 조직이 완전히 분해 될 때까지 10 ㎖의 유리 피펫 수회 미디어 씹다 조직. </li><li> 바이알의베이스에 최대한 가까운 피펫 팁을 유지한다. </li><li> 파편과 해리되지 않은 부분을 제거하기 위해 필터 상에 용액을 증착. </li><li> 원심 RT에서 5 분 동안 150 XG에서 미디어 세포 현탁액을 여과 하였다. </li><li> 그 후 상층 액을 제거하고 2 ml의 신선한 문화 매체와 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 (필요한 경우)을 사용하여 세포를 카운트. 종자는 세포 외 기질 (ECM) 작용 젤 원하는 농도의 폴리스티렌 요리에 기본 세포입니다.</li></ol> 3. 준비 및 다른 강성 폴리 아크릴 아미드 (PA) 젤과 폴리스티렌 기판의 기능화 참고 : 제 3의 시각 데모를 들어, 시청자가 / 독자가 가시화 실험의 최근 저널 (주피터) 제 17 조라고합니다. <ol><li> 채택 공개 프로토콜 18, 19, 12mm 2 유리 커버가 하이드로 겔의 공유 결합을 보장하기 위해 화학적으로 미끄러 활성화. <ol><li> 첫째, 치료 유리 커버 실온에서 7 분 동안 3 Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)로 미끄러 져. </li><li> DI 물 린스 완전히 ATS를 제거하고 치료 커버 (70 % 글루 타르 알데히드 주식 솔루션에서 PBS에 희석) 0.5 % 글루 타르 알데히드 30 분 동안 용액으로 미끄러 져. </li></ol></li><li> / V 아크릴 아미드 솔루션 및 0.05 %, N, 10 mM의 HEPES 완충 식염수 (20)에 N &#39;-methylenebisacrylamide (비스) 솔루션 승 5 %를 혼합하여 2 kPa의 젤 솔루션을 얻습니다. / V 아크릴 아미드 0.13 승 8 %를 사용% N, 10 kPa의 젤 (20) 10 mM의 HEPES 완충 식염수에 N &#39;-methylenebisacrylamide (비스) 솔루션입니다. <ol><li> 200 황산 암모늄 (/ w 10 % V) 및 1 : 두 경우 모두 1을 사용 2,000 N, N, N &#39;, N&#39;각각 중합 공정 용 개시제 및 촉매로서 -tetramethylethylenediamine (TEMED). </li><li> 또한, 신탁 마커 (21, 22)로 2 인민군 겔 용액 100 μL 형광 구슬을 추가합니다. </li></ol></li><li> 20 μL 12mm이 활성화 된 유리 커버 슬립에 미리 PA 고분자 겔 용액의 방울을 증착. 드롭 다른 12mm 2 일반 유리 커버 슬립을 놓습니다. 드롭 인해 모세관 현상에 커버 슬립 사이에 퍼져 있는지 확인합니다. 2 kPa의 겔 비드가 대부분 세포 배양 표면 가까이 오지 않도록하기 위해 샌드위치 전환. </li><li> 실온에서 45 분 동안 PA 젤 치료. </li><li> 하나의 가장자리 면도기를 사용하여 상단 커버 슬립을 벗겨. 참고 : 필링 동안 분리 한 가장자리에서 진행샌드위치. 겔은 활성화 된 유리 슬라이드에 접착 유지된다. </li><li> 사용하기 전에 PBS 용액에 젤을 저장합니다. </li><li> 50 μg의 / ㎖ 출판 다음 방법 (23)의 농도로 PA 젤과 ECM 분자, 인간 피브로넥틴 유리를 기능화. <ol><li> 간단히, 2 ml의 순수한 히드라진 하이드레이트 O / N과 기판을 품어. </li><li> 히드라진 하이드레이트를 제거하고 탈 이온수로 철저하게 기판을 씻어. </li><li> 30 분 동안 5 % 아세트산으로 기판을 세척 할 것. </li><li> 아세트산을 제거하고 탈 이온수로 철저하게 기판을 씻어. </li><li> 30 분 동안 탈 이온수에 침지 기판을 유지합니다. </li><li> 50 μg의 / ml의 농도에서 35 분 동안 산화 피브로넥틴과 기판을 품어. </li><li> 10 분 동안 낮은 rpm에서 진탕에 PBS로 기판을 씻어. </li><li> 세포를 도금하기 전에 30 분 동안 2-3 ml의 배양 배지에서 37 ° C에서 모든 기판을 품어. 참고 : 플레이트 세포를 띄엄 띄엄 채우기에D 방식 (1,000-3,000 세포 / ㎠). 각 겔 피복 유리 슬립은 35mm 페트리 접시에 포함되어야한다. 세포가 어떤 현미경 (적어도 O / N) 전에 완전히 준수하도록 허용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 견인 힘 현미경과 면역 형광 현미경 분석 실험 <ol><li> 견인 힘 현미경 분석 <ol><li> 10 분 동안 물을 욕조에 37 ℃의 따뜻한 0.25 % 트립신 - EDTA / 10 % SDS 솔루션 견인 실험을 시작하기 전에. </li><li> 한번에 세포 배양 인큐베이터에서 한 겔을 분리하여 형광 현미경 반전 스테이지 (32X 배율)에 배치했다. </li><li> 시야에서 하나의 셀을 찾을 수 있습니다. 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 셀의 위상차 이미지 (예를 들어,도 3)을 가지고. </li><li> 형광 적절한 필터를 선택할 수있는 영상 모드를 전환합니다. 이 시간 동안 현미경 단계 또는 샘플을 이동하지 마십시오. </li><li> 형광 비드 displac의 이미지를 촬영휴대 견인 (그림 4C)에 의해 에드. </li><li> 겔에서 세포를 분리 배양 접시에 1 ml의 트립신 / SDS 솔루션을 추가합니다. 이 시간 동안 현미경 단계 또는 샘플을 이동하지 마십시오. 또한, 겔의 완전한 제거를 보장하기 위해 셀의 제어 영상을 취할. </li><li> 세포가 제거 된 후 비드 기준 (NULL 힘) 이미지를 가져. </li><li> 다른 모든 젤에 대한 단계를 반복 4.1.2-4.1.8. </li><li> 각각의 경우에 대한 단계 4.1.6과 4.1.8에서 획득 한 두 개의 이미지에서 ImageJ에를 사용하여 이미지 스택을 확인합니다. 스택 스택 → 이미지 → 이미지 : 이미지 스택을 생성하려면, 이미지를 연 후 ImageJ에의 명령 다음과 같은 순서를 사용합니다. </li><li> . 변위 필드와 견인을 얻으려면, 발표 방법 (21), (22) 다음 ImageJ에 플러그인을 사용하여 다음과 같은 링크를 사용하여 이러한 플러그인에 대한 코드와 상세한 튜토리얼을 얻 <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima을</a>gejplugins. <ol><li> &#39;템플릿 매칭&#39;플러그인을 사용하여 스택의 이미지를 맞 춥니 다. → 확인을 스택에 플러그인 → 템플릿 매칭 정렬 조각 → : 단계 4.1.10에서 생성 된 이미지 스택을 연 후 ImageJ에의 명령 순서 다음 사용. 결과적으로 이미지 스택을 저장합니다. 다음 단계에서이 새로운 이미지 스택을 사용합니다. </li><li> PIV (입자 영상 유속계) 플러그인 (그림 4D)를 사용하여 변위 필드를 얻습니다. 단계 4.1.11.1에 저장된 이미지 스택을 연 후 명령의 순서 다음 사용 : 플러그인 → PIV → 반복 PIV (기본) → → 확인 확인 →이 PIV 및 출력을 수락합니다. 원본 이미지 스택과 동일한 디렉토리에있는 PIV 출력을 저장합니다. 다음 단계에서 입력으로 사용합니다. </li><li> 마지막으로 FTTC 견인지도 (그림 4E)을 얻기 위해 플러그인을 (푸리에 세포 계측법 견인 변환)를 사용합니다. 명령을 사용하여 다음과 같은 순서 : 플러그인 → FTTC → 기능ERT의 재료 특성, 즉, 탄성 계수 및 PA 젤 → 확인 →의 포아송 비는 확인 → 단계 4.1.11.2에 저장된 PIV 출력 파일을 선택합니다. 저장 FTTC 이미지 스택과 PIV 출력과 동일한 디렉토리에 발생합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 면역 형광 현미경 분석 실험 <ol><li> 층류 후드에 면역 염색 할 수있는 기판 가지고 배양 배지를 제거합니다. </li><li> PBS로 기판을 세척하여 실온에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 고정합니다. </li><li> 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. 따라서, 30 분 동안 500 ㎕의 신호 인핸서와 기판을 배양하고 PBS로 헹군다. </li><li> 실온에서 45 분 동안 PBS 250 희석 : 1 단일 클론 항 vinculin 항체와 세포를 품어. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> (200) 희석 : 1 차 항체 알렉사 플 루어 488 염소 항 마우스 IgG를 가진 샘플을 품어실온에서 30 분 동안 PBS에서. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> F - 굴지 구조를 시각화하기 위해, TRITC 실온에서 45 분 동안 농도를 50㎍ / ㎖에서 접합체를 Phalloidin의와 세포를 품어. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> 이미지 공 초점 주사 레이저 현미경을 사용하여 샘플 (도 5a -도 5d). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

셀룰러 견인 스트레스는 최근 전이 상태 (13)의 잠재적 인 생물 물리학 적 지표로 떠오르고있다. 그러나 차 종양 세포와의 실험 견인 데이터는 현재까지 문헌에 존재하지 않습니다. 또한, 다른 강성 폴리 아크릴 아마이드 젤에 직접 배양 고립 된 차 대장 세포는 아직보고되지 않습니다. 따라서, 우리는 겔 및 폴리스티렌 (도 2)에 최적화 된 일차 결장 세포 배양 조건을 확립한다....

기계적인 미세 환경은, 생화학 적 요인 외에, 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것이 최근 점점 분명하게되었다. 세포를 감지하고이 3-7 (2D 배양에서와 같이)에 부착 또는 (3D 배양에서와 같이)에 의해 포위되어있는 기판의 강성에 응답 할 수있다. 이렇게함으로써, 세포 분화 3, 4 형태, 이주 / 운동성 5 바이오 물성 (6), (7)의 성장 및 기타 프로세스를 변조 할 수있다. 암세포는 또한 접착 수용체의 조정, 계층 - 기계 화학적 결합과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 2 차원 및 3 차원 매트릭스 강성 응답한다. 예를 들어, 유선 상피 세포 (MEC의) 150 아빠 기판에 배양 할 때 강성과 유사 정상적인 선포 실질을 형성건강한 유방 조직. 흥미롭게도, 이들은 종양 기질 (8)의 강성을 모방 딱딱한 기판 (&gt; 5,000 PA)에서 배양 구조와 전사 모두 현상 종양의 특징은 나타낸다. 또 다른 실험은 유방 종양 콜라겐 가교 ECM 9 보강 동반되는 것을 나타낸다. 최근의 실험들은 생리적으로 중요한 강성 (20-47 kPa의)을 갖는 2 차원 기판에서 배양 있지만 (3.6 GPA) 기판 상에 매우 뻣뻣하지 않을 때 인간 결장암 (HCT-8) 세포 표현형 (MLP) 등의 전이를 표시하는 것을 보여준다 10- 제 12 .These 셀 폼과 같은 종양 세포 클러스터와 그 주변부터 서로 해리. 변화는 그들은 세포 - 세포 및 세포 - ECM 부착을 줄이고, 철새가, 확산, 발생 (R 전환에 E) 둥근 형태이 상피로. 이 발생하지 않는 매우 어려운 폴리스티렌 기판에 HCT-8 세포 배양악성 특징. 따라서이 HCT-8 세포 인해 적절한 미세 환경에 대한 노출로 전이 될 수 있음을 가정하고있다. 이들 실험이없는 일차 인간 암 세포 불멸화 암 세포주 또는 일차 쥐 유래 세포로 수행되는 것을 주목할 필요가있다. 최근 연구 증강 셀룰러 트랙션 응력 전이성 세포 13 국지적 연구는 폴리 아크릴 아미드 겔에서 다른 인간 암 세포주에 대한 견인력을 측정하는 것을 포함하는 잠재적 생물 리 학적 특성으로서 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 또한, 전이성 암세포가 모든 경우에 13 비 전이성 세포에 비해 상당히 높은 트랙션 응력을 발휘할 수있는 것을 알 수있다. 그러나,이 결과는 직접적으로 유도 뮤린 유방암 세포주 (14)에 앞서 발표 결과와 모순. 또한, 최근의 연구는 세포 골격 리모델링 프로 불후 및 기본 인간의 세포 사이에 현저한 차이를 강조TEIN 프로파일과 세포 생존 단백질 발현 15. 따라서, 일차 인간 암 세포에 대한 견인을 포함한 생물 물리학 적 분석의 많은 방문하는 것이 중요하다. 일차 세포가 불멸화 된 암 세포주 견인 경향 요점을 되풀이 것인지 이는 질문을 다룰 것이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부드러운 기판 (폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔)뿐만 아니라에 페트리 접시에 그들을 배양 (건강과 암 모두) 주 인간의 대장 세포의 분리에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 소화 및 단일 세포 현탁액 (16)에 외과 적 조직 샘플의 결과의 효소 분해에 기초한다. 우리가 아는이 직접 세포 계측법 견인 용 내장형 형광 마이크로 비드와 부드러운 하이드로 겔 기판에 절연 차 대장 암과 정상 세포를 배양의 첫 번째 데모입니다. 투명 겔 기판은 또한 면역 염색을 할​​ 수 있습니다. 이 분석은 밝혀 F - 굴지 조직의 차이기판 강성 변화와 같은 주요 인간의 대장 세포에 초점 유착. 이 세포 배양 플랫폼은 암 사전 진단을위한 매개 변수로 셀 강성과 견인 1 차 인간 세포의 다양한 생물 물리학 적 특성을 탐구의 가능성을 열어.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenese</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>01201-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N- methylenebisacrylamide (bis)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#714;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human fibronectin</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td >354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >18412</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Signal enhancer</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I36933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monoclonal anti vinculin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V9131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRITC phalloidin conjugates&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.1 &#181;m fluroscent beads</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 mm2 glass cover slips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2865-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary human colon tumor cells from surgical tissues and culturing them directly on soft elastic substrates for traction cytometry

암 세포 접착 수용체 이루어지는 코디 계층 - 기계 화학적 시스템과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 복잡한 방식으로 기계적 강성 매트릭스 응답. Mechanosensitivity를 다른 암세포의 시험관에 하지 일차 인간 암 세포 불멸화 세포주 또는 일차 세포를 쥐 유래, 주로 연구 하였다. 따라서, 작은 시험관 일차 인간 대장 암 세포의 mechanosensitivity 대해 공지되어있다. 여기서, 최적화 프로토콜은 건강한 인간 암 수술 조직 샘플로부터 일차 인간 결장 세포의 분리를 설명하는 현상된다. 고립 대장 세포를 피브로넥틴 (세포 외 기질에 의해 기능화 기판 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔과 강성 폴리스티렌 (~ 3.6 GPa의 강성) (10 kPa의 강성) (2 kPa의 강성) 부드럽고 뻣뻣한에 성공적으로 배양이 경우에). 형광 마이크로 비드를 세포 배양 표면 근방 소프트 겔에 포함되고, 정지 마찰 분석법 자유로운 개방형 액세스 소프트웨어를 이용하여 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행된다. 또한, 다른 강성 기판상의 면역 형광 현미경 검사는 기판의 강성의 함수로서 초점 유착을 함유하는 일차 전지의 형태, 세포 골격 조직 및 vinculin에 대한 유용한 정보를 제공한다.

위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 기관 검토위원회의 지침에 따라 네 가지 환자에서 여러 조직 샘플 (N = 12)을 위해 사용된다. 그림 1A 바로 세포 배양에 대한 조직 섹션이 얻을 수있는 수술 후 대표적인 대장 종양을 보여줍니다. 추가 처리를 위해 층류 후드 전사 후 HBSS 용액 전형적인 조직 절편은도 1b에 도시되어있다. 소화 및 단일 세포 현탁액으로 수술 조직 샘플의 ...

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Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

isolation-primary-human-colon-tumor-cells-from-surgical-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses. 

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Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of &gt;50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.

Circulating tumor cells are isolated from the blood of cancer patients without inflicting cellular damage. Isolation of tumor cells is accomplished using a bimolecular surface of E-selectin in addition to antibodies against epithelial markers. A nanotube coating specifically promotes cancer cell adhesion resulting in high capture purities.

환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

연구

생체공학

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

외과 검색, 분리 및<em&gt; 체외</em&gt; 조직 공학 응용 프로그램에 대한 인간의 전방 십자 인대에서 파생 된 세포의 확장

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should mimic the human tissues they are aiming to replace; to provide the required anatomical shape, the materials must be able to sustain the mechanical forces they will experience when implanted at the defect site. Although the mechanical properties of tissue-engineered scaffolds are of great importance, many human tissues that undergo restoration with engineered materials have not been fully biomechanically characterized. Several compressive and tensile protocols are reported for evaluating materials, but with large variability it is difficult to compare results between studies. Further complicating the studies is the often destructive nature of mechanical testing. Whilst an understanding of tissue failure is important, it is also important to have knowledge of the elastic and viscoelastic properties under more physiological loading conditions.
This report aims to provide a minimally destructive protocol to evaluate the compressive and tensile properties of human soft tissues. As examples of this technique, the tensile testing of skin and the compressive testing of cartilage are described. These protocols can also be directly applied to synthetic materials to ensure that the mechanical properties are similar to the native tissue. Protocols to assess the mechanical properties of human native tissue will allow a benchmark by which to create suitable tissue-engineered substitutes.

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

들여 쓰기 및 인장 시험을 사용하여 인간의 부드러운 조직의 생체 역학적 특성

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.