이 방법은 면역 시냅스에서 B 세포에 의해 적용된 힘의 공간 측두체 분포를 측정하고 특정 단백질의 모집과 상관관계를 가능하게 한다. 폴리아크릴아미드 젤을 사용한 견인력 현미경 은 구현하기 쉽습니다. 이 프로토콜은 많은 B 셀의 기계적 능력의 측정을 신속하게 설정하는 데 사용할 수 있습니다.
이 방법은 유연하고 인테그린과 같은 다른 리간드를 그래프로 만들거나 T 세포 또는 좌절된 식세포증과 같은 다른 종류의 면역 시냅스를 연구하도록 조정할 수 있습니다. 이 실험에 필요한 젤의 물리적 및 화학적 특성으로 인해, B 세포에 대한 고전적인 견인력 현미경 검사법의 적응이 까다로울 수 있다. 젤 지지대를 살리는 것으로 시작합니다.
커버슬립 또는 유리 바닥 페트리 접시를 UV 램프로 2분간 활성화한 다음 200마이크로리터의 APTMS로 5분간 살린다. 이것은 젤의 공유 결합에 대한 지원을 준비할 것입니다. 커버슬립이나 유리 바닥 접시를 초순수물로 철저히 씻고 진공 포부를 사용하여 건조시키십시오.
젤을 평평하게 하기 위한 커버립을 준비하려면 세라믹 커버슬립 홀더에 넣고 홀더를 작은 비커에 넣고 커버립 위에 실리콘화 시약을 부어 완전히 덮습니다. 비커를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 3분간 둡니다. 한편, 초순수의 물로 큰 비커를 채우는 다.
실리콘 시약에서 3 분 동안 인큐베이션을 한 후 커버슬립 홀더를 커버립립으로 물로 비커로 옮습니다. 커버립을 초순수물로 철저히 헹구세요. 잘 말리고 종이 물티슈에 놓습니다.
최상의 결과를 얻으려면 즉시 젤 중합을 진행하십시오. 원고 방향에 따라 500 파스칼 젤 프리 믹스를 준비한 다음 사전 혼합의 167 마이크로리터와 1.67 마이크로리터의 구슬을 결합합니다. 소용돌이와 5 분 동안 목욕 초음파 처리기에서 혼합물을 초음파 처리합니다.
알루미늄 호일로 빛으로부터 믹스를 보호합니다. 중합을 활용하려면 1.67 마이크로리터를 젤 믹스에 10%암모늄 아설페이트에 추가한 다음, TEMED 0.2 마이크로리터를 추가하고 젤을 파이펫과 혼합하여 중합화를 시작합니다. 젤을 캐스팅하려면, 젤의 파이펫 아홉 마이크로리터는 각 살리니화 커버 슬립 또는 유리 바닥 접시에 혼합.
즉시 실리콘 커버슬립으로 젤을 평평하게 하고, 겔이 커버슬립의 전체 영역에 퍼지고 그 중 일부가 누출되도록 집게로 밀어 내밀어 주세요. 커버슬립 이나 유리 바닥 접시를 큰 페트리 접시에 넣고 벤치에 두드려 구슬을 젤 표면쪽으로 강제로 넣습니다. 젖은 챔버를 만들기 위해 접시에 가습 된 조직을 놓습니다.
알루미늄 호일로 덮고 1시간 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 샘플에 PBS를 추가하여 커버슬립 방출을 용이하게 한다. 조심스럽게 바늘로 커버 슬립을 제거하고 접시를 약간 기울이지만 젤이 PBS에 잠겨 있는지 확인하십시오.
실리콘화제, 아크릴아미드, 베이스 아크릴아미드 및 TEMED는 흡입에 의해 독성이 있을 수 있다. 표준 개인 보호 장비를 착용하고 화학 후드에서 이러한 제품을 조작하십시오. 젤에서 PBS를 흡습하고 실온에서 150 마이크로리터의 Sulfo-SANPAH를 추가합니다.
젤을 UV 처리에 2분 간 노출한 다음 PBS로 젤을 세 번 씻습니다. Sulfo-SANPAH및 PBS 세시로 처리를 반복한 다음, 젤에 암탉 계란 리소지메 또는 HEL의 250 마이크로리터를 추가하고 알루미늄 호일로 덮인 섭씨 4도의 습도 챔버에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, HEL 항원을 제거하고 PBS로 젤을 세 번 세척합니다.
마지막으로, B 세포 배양 배지의 500 마이크로 리터로 젤을 덮고 실온에서 둡니다. 화상 진찰을 위해 열 및 이산화탄소 제어와 공초점 현미경을 사용합니다. 젤에서 미디어를 흡인하여 약 200마이크로리터를 남깁니다.
현미경에 젤을 배치합니다. 구슬의 두 가지 주요 층은 젤의 바닥과 상단에 나타납니다. 젤 평면에 초점을 맞추고 이미지에 짝수 영역을 찾을 수 있습니다.
이미징 영역을 신중하게 선택하고 집중해야 합니다. 적절한 비드 밀도와 균일한 표면은 견고하고 신뢰할 수 있는 힘 측정을 얻는 데 핵심적인 것입니다. MD4 마우스에서 젤에 1차 B 림프구 의 80 마이크로리터를 추가하여 젤을 만지지 않도록 초점을 유지합니다.
초점이 여전히 정확하고 해당 셀이 영역에서 내림차순으로 보이는지 확인합니다. 세포가 젤에 도달하기 전에 인수를 시작합니다. ImageJ에서 이미지 스택으로 영화를 열고 매크로 cropandsave.ijm을 실행합니다.
출력 디렉토리를 선택하고 특성 채널 설정을 구성합니다. 직사각형 도구를 사용하여 관심 영역을 선택하고 T 키를 사용하여 ROI 목록에 추가합니다. 완료되면 확인을 클릭합니다. 매크로가 셀의 마스크를 제안하면 만족스러운 경우 확인을 클릭합니다.
만족스럽지 않은 경우 확인을 클릭한 다음 선택 도구가 있는 닫힌 지역을 수동으로 선택한 다음 계속 클릭합니다. MATLAB을 열고 tfmv1.m 실행합니다. 필요한 매개 변수를 입력합니다.
구체적으로, 픽셀 크기 및 획득 시간 간격 및 영 계수 E 및 푸아송 비율과 같은 젤 특성과 같은 이미지 특성을 확인하십시오. 완료되면 원본 파일과 동일한 디렉터리에서 소프트웨어의 출력을 찾습니다. 올바른 비드 이미지는 별이 빛나는 하늘과 유사한 밝은 반점의 균일하고 임의로 분포하는 것처럼 보입니다.
구슬 수가 너무 적거나 이미지가 초점이 부족할 때 데이터 및 분석은 신뢰할 수 없습니다. 기판으로 세포의 첫 접촉에 앞서 기준 프레임을 사용하여 눈으로 구슬의 움직임을 관찰할 수 있다. 대략적인 결과는 단일 입자 추적에서 얻을 수 있습니다.
분석은 참조 이미지에서 구슬의 분할을 컨트롤로 제공합니다. 소프트웨어를 사용하면 각 픽셀 및 매 시지점에서 로컬 응력의 벡터인 변위 및 응력 필드를 얻을 수도 있습니다. 셀 영역에 통합된 변위 및 힘 필드의 스칼라 제품은 기판상에 있는 셀에 의해 발휘되는 총 작업을 제공한다.
두 가지 생물학적 조건을 비교할 때, 에너지가 고원에 도달하는 마지막 시간 점에 걸쳐 평균 곡선 또는 평균 값을 계산할 수 있습니다. 힘의 공간 정보가 관련이 있는 경우 각 조건의 단일 시간 점을 비교할 수도 있습니다. 형광 항원 추출 시간 경과의 예가 여기에 나와 있다.
시냅스에서 형광 신호의 점진적인 출현은 젤에서 항원 분리를 나타낸다. 형광 데이터는 평균 추출 곡선을 구성하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜에서 가장 섬세한 단계는 커버슬립 아래겔의 중합화이다.
이 단계는 젤이 커버슬립 아래에 균일하게 압착되도록 비교적 신속하고 신중하게 수행해야 합니다. 이 절차에 따라 B 림프구를 발현하는 형광 단백질을 동시에 세포 내 구조와 힘 패터닝의 국소화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 세포 수축도 및 항원 통풍관에 특정 단백질의 역할을 평가하기 위하여 유전 또는 화학적인 동요와 결합될 수 있습니다.
