생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

이 프로토콜을 통해 사용자는 마우스 망막 영상에서 임상적으로 유사한 손상 마커를 정량적으로 측정할 수 있으며, 이는 후속 결과의 번역 가능성을 강화합니다. 이러한 방법을 통해 분석을 간소화하고 실험 동물 간의 이미징을 안정적으로 비교할 수 있습니다. 이러한 방법은 마우스 모델 개요를 연구하기 위해 개발되었지만 동일한 이미징 기술을 사용하는 망막 질환에 대한 연구로 쉽게 확장 할 수 있습니다.

망막 영상 현미경 라이트 박스, 광학 간섭 단층 촬영 기계 및 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다. 컴퓨터를 켜고 이미징 프로그램을 엽니다. 각 눈에 페닐에 프린과 트로피 아미드 한 방울을 첨가하십시오.

100 마이크로 리터의 1 % 플루오레세인을 복강 내 주사하십시오. 플랫폼에 마우스를 수용하십시오. 망막 안저의 시야가 선명하고 초점이 맞춰질 때까지 플랫폼의 높이와 각도를 조정하십시오.

안저 사진을 찍습니다. 이미징 및 광학 간섭 단층 촬영 소프트웨어를 엽니다. 광학 간섭 단층 촬영 프로그램에서 넛지를 10으로 조정합니다.

광학 간섭 단층 촬영 이미지를 가져 와서 화상에서 75 마이크로 미터 떨어진 곳에 추가하십시오. 망막의 다른 세 사분면에 대해 반복하십시오. 카메라를 488나노미터 필터로 전환합니다.

카메라 게인을 5로 늘립니다. 플루오레세인 주사 후 정확히 5분 후에 안저 사진을 찍습니다. 이미지 처리 소프트웨어에서 플루오레세인 이미지를 엽니다.

이미지를 복제합니다. 선택 도구를 사용하여 주요 선박을주의 깊게 추적하십시오. 이 선박에서 분기되는 선박은 무시하십시오.

첫 번째 이미지에서 선택 항목을 삭제하고 선박 만 남겨 둡니다. 이 마스크된 이미지를 저장합니다. 선택 영역을 두 번째 이미지로 이동하고 선택 영역을 반전하고 삭제하여 배경을 분리합니다.

이 마스크된 이미지를 저장합니다. 배경 이미지를 열고 통합 밀도를 측정합니다. 혈관 이미지를 열고 혈관의 윤곽을 선택한 다음 평균 강도를 측정합니다.

배경의 통합 밀도를 혈관의 평균 강도로 나누어 눈의 누출 비율을 생성합니다. 실험 코호트에서 각 눈에 대한 이 누출 비율을 기록합니다. 배경을 추가로 제어하려면 실험용 눈을 다치지 않은 대조군 눈의 평균 누출 비율로 정규화합니다.

이미지 처리 소프트웨어에서 광학 간섭 단층 촬영 이미지를 엽니다. 신경절 세포층, 내부 플렉시 폼 층, 내부 핵층, 외부 플렉시 폼 층, 광 수용체 층 및 RPE 층의 경계를 추적하십시오. 파일을 CSV로 내보냅니다.

각 층의 평균 두께를 측정하고 실험 코호트에서 각 눈에 대해 반복합니다. 이미지 J에서 광학 간섭 단층 촬영 이미지를 엽니 다. 선 도구를 사용하여 외부 플렉시 폼 층의 상단 경계가 불명료 한 거리를 측정합니다. 무질서가 시작되는 위도를 유지하면서 수평으로 측정하십시오.

이미지에서 무질서한 거리의 합을 계산합니다. 무질서의 길이를 망막의 전체 길이로 나누어 무질서의 비율을 구하십시오. 망막의 다른 세 사분면으로부터의 광학 간섭 단층 촬영 이미지에 대해 측정 및 계산을 반복하십시오.

4 개의 광학 간섭 단층 촬영 이미지에서 무질서 비율의 평균을 취하십시오. 이 숫자는 전체 망막의 평균 무질서를 나타냅니다. 실험 코호트의 각 눈에 대해 반복합니다.

각 망막 영상에 대한 누출 비율 계산에 사용되는 마스킹 된 이미지는 다른 이미지와 비교하고 분석하여 망막의 다른 영역과 주요 혈관계를 분리 할 수 있습니다. Fluorescein 정량화는 부상 심각도와 치료 효능의 비교뿐만 아니라 부상 시간 경과에 따른 누출 변화에 대한 연구를 허용합니다. OCT 이미지에서 망막 층의 윤곽이 관찰됩니다.

각 망막 층에 대한 두께의 정량화는 초기 부종 반응이 내부 망막 층에 더 큰 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 망막 정맥 폐색 손상의 시간 경과 분석에서 망막 층의 초기 염증성 부종 및 최종 퇴행성 얇아짐이 관찰 될 수 있습니다. 내부 핵층은 초기 손상에 대해 훨씬 더 큰 반응을 경험하지만 내부 플렉시 폼 층은 초기 부종이 안정화되고 기준선으로 돌아온 후 더 심한 얇아짐을 나타냅니다.

내부 망막 층의 해체는 외부 플렉시 폼 층의 상부 경계가 사라지는 것으로 나타나 외부 플렉시 폼과 내부 핵 층을 함께 혼합합니다. 망막 손상을 완화시키는 억제제의 효능을 조사하기 위해 두 실험 그룹의 망막 해체를 비교했습니다. 이미지 품질은 분석 품질에 매우 중요합니다.

망막 이미지를 획득 할 때 시간을내어 안저층과 망막 층이 가능한 한 선명하고 집중되어 있는지 확인하십시오. 이러한 비 침습적 방법은 종단 적으로 그리고 조직의 생화학 및 면역 조직 화학적 연구와 함께 사용하여보다 다각적이고 상세한 질병 프로파일을 만들 수 있습니다. 이 기술은 신경 혈관 질환 모델에서 생체 내 망막 영상 데이터의 신뢰할 수있는 정량화를 가능하게하여 데이터를보다 쉽게 인간 질병으로 변환 할 수 있습니다.