이 작품은 Wellcome 트러스트와 영국 심장 재단에 의해 후원되었다.

달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다. 1. 출생 후의 눈의 안구 적출술 및 고정 <ol><li> 옆에 강아지 인도적 사망 마우스를 놓고 가위로 눈을 덮고있는 피부를 제거합니다. </li><li> 눈을 명백히 가위와 집게를 사용합니다. </li><li> 탈핵 눈 아래 장소 가위는 시신경과 주변 조직을 잘라 눈을 밖으로 들어 올립니다. 실온에서 2 배 PBS에서 만든 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 전송할 수 있습니다. </li><li> 각각의 눈은 10 수정 할 수 있습니다 - 10 분 - 15 분 후, 5 얼음 차가운 배 PBS로 전송할 수 있습니다. 그것은 고정의 정도가 각각의 눈에 대한 동일한지 확인 enucleations 및 후속 고정을 엇갈리게하는 것이 좋습니다. </li></ol> 2. 출생 쥐과 망막의 해부 <ol><li> 2X PBS를 포함하는 페트리 접시에 전송 눈들이 상자 아래에 구멍과 장소를 넓혀 절단 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여현미경을 cting. </li><li> 집게와 가위를 사용하여 눈 주위 모든 지방을 제거합니다. </li><li> 피어스 날카로운 가위로 각막의 가장자리와 각막과 홍채 및 폐기 주위를 잘라. </li><li> 망막과 공막 사이에 집게를 삽입하고 망막을 찢어지지 않도록주의하면서 공막를 제거합니다. 맥락막 층도 제거 할 수 있지만,이 단계에서 발생하는 망막 손상의 위험이있을 경우, 맥락막 층은 크게 면역 염색의 품질에 영향을 미치지 않아야로에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 렌즈와 집게를 사용하여 유리체 유머를 제거합니다. </li><li> 미세 집게로 눈의 중앙에 그들을 함께 수집하여 hyaloids 혈관을 제거 후 신속하게 망막의 중심 (또는 미세 가위로 유리체 혈관의 기지에서 싹둑)에서 멀리 당기십시오. </li><li> 깨끗한 페트리 접시에서 PBS와 컵 모양의 망막을 씻어. </li><li> 봄 scisso를 사용하여 망막의 반지름의 약 2 / 3에 도달 4 ~ 5 방사상 절개를 만들기RS는 &#39;꽃잎&#39;모양을 만들 수 있습니다. </li><li> PBS는 망막을 평평하게 파스퇴르 피펫을 사용하고 흡수성 종이의 작은 조각으로 초과 PBS를 제거 꺼립니다. </li><li> 천천히 피펫 추위 (-20 ° C) 망막의 표면에 놓기로 메탄올 드롭 완전히 추가 메탄올로 다음 홍수 덮여 때까지. 이 망막을 고정하고 permeabilization을 용이하게하는 데 도움이됩니다. 망막은 흰색으로 바뀝니다. </li><li> 구멍을 넓혀 절단 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 2 ㎖ 튜브에 옮긴다. </li><li> 면역 염색을 진행하기 전에 적어도 20 분 동안 차가운 메탄올 망막을 남겨주세요. 여기에 사용 된 항체의 단지 VE-cadherin의 메탄올 고정 망막에서 성공적으로 사용할 수 없습니다. 이 경우 망막 9 단계 후 면역 염색으로 바로 진행해야합니다. </li><li> 필요한 경우 최대 전에 염색을 몇 개월에 대해, 망막은 -20 ° C에서 메탄올에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 면역 / 망막 Vascu의 isolectin 염색lature <ol><li> 조심스럽게 제거 / 메탄올을 넣어 부드럽게 (이 단계에서 망막 위의 단계 11에서 동일한 2 ㎖ 튜브에 아직도있다) PBS에서 간단히 망막을 씻어. </li><li> 파마 / 차단 솔루션을 100 μL와 PBS와 커버 망막을 제거 (PBS + 0.3 % 트리톤 + 0.2 % BSA) + 5 적절한 혈청 % (표 1 참조), 1 시간 동안 가볍게 흔 듭니다. </li><li> 부드러운 4에서 하룻밤 흔들어 ° C 100 선택한 기본 항체의 μL (표 1 참조) 및 / 또는 IsolectinB4, 파마 / 블록에 희석하여 준비 모두와 함께와 망막을 차단하고 배양 / 파마 제거합니다. </li><li> 항체 / isolectin를 제거하고 망막 4 씻어 PBS에서 x 10 분 + 0.3 % 트리톤 (PBSTX). </li><li> 어떤 경우에는, IsolectinB4-Alexa488 또는 직접 복합 일차 항체로 예를 들면 다음과 염색, 이차 항체는 필요하지 않습니다 및 망막 (7 단계)에 직접 장착 할 수 있습니다. 접합 일차 항체은 해당 플 루어 100 μL 다음 3 단계에서 사용되었을 때escent 이차 항체 (PBSTX에서 1 / 200 희석)을 첨가하고 4 ℃ 실온에서 4 시간 동안 밤새 품어 남아 있습니다. </li><li> 이차 항체를 제거하고 2 ㎖ PBSTX에서 망막 4 X 15 분 씻으십시오. </li><li> 넓은 구멍 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에 망막을 전송하고 흡수성 티슈로 여분의 PBSTX를 제거합니다. 50 μl를 추가하여 마운트 망막은 망막에 coverslip을 부드럽게 위치에 mountant을 연장. </li><li> 전송 그들은 연장 mountant 설정 할 수 있도록 평평하고 빛으로부터 보호 될 수 있도록, 4 ° C에서 하룻밤 냉장고에 슬라이드. </li><li> 이미지 망막 공 촛점 현미경 또는 epifluorescence에 현미경을 사용. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. 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Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia.">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 제시된 방법은 혈관의 쉽게 정량화 및 생리학 관련 모델을 만들고, 신생아 마우스 망막의 스테인드 전체 마운트 준비의 이미지를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 처음에는 마우스 아이는 작은 크기와 지구본 모양으로 인해 해부하는 것은 매우 어려울 수 있습니다, 연습과 좋은 해부 도구는 신뢰할 수있는 결과를 위해 필요하므로. 이 눈에서 물 손실 소량의 원인과 절?...

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 형성에 의해 정의 된 여러 신호 전달 경로에 의해 조절되는 복잡한 발달 과정입니다. 이들 중 가장 눈에 띄는 VEGF 경로입니다. VEGF는 주변 혈관의 싹이 혈관의 개시에 허혈성 세포와 리드에 의해 발표된다. 새싹 새 혈관에서 선도적 인 내피 세포는 VEGF의 근원을 향해 밖으로 도달하는 filopodia를 생산하는 &#39;팁&#39;세포이며, &#39;줄기&#39;내피 세포 증식옵니다. 이러한 방법으로, 활성화 된 내피 세포는 마이그레이션하고 새로운 혈관 튜브를 형성하는 곳 무혈성 지역으로 확산. 혈액의 흐름을 지원하기 위해 이러한 튜브를 안정화하기 위해, 내피 세포는 혈관 주위 세포와 새로운 혈관 1 서라운드 평활근 세포와 상호 작용합니다. 혈관은 태아 성장 조직의 혈관을 위해 필수적이다. 그러나, 그것은 또한 많은 pathologi에 기여암과 같은 칼 장애, 혈관의 결함은 허혈성 질환과 관련된 반면. 질병을 치료하는 수단으로 혈관 신생을 조절하는 효과적인 약물 치료의 개발은 큰 관심을 따라서이다. 예를 들어, 효과적인 안티 - 혈관 요인은 암의 성장을 줄일 프로 혈관 전략 허혈성 질환을 치료하는 데 사용할 수있는 반면됩니다. 따라서, 혈관의 모델은 더 나은 새로운 혈관 형성과 혈관 성장을 강화하거나 줄일 수있는 새로운 치료 전략을 개발하기위한 규정을 이해하는 것이 필수적입니다. 혈관 연구의 기본적인 요소는 적절한 혈관 모델의 선택입니다. 체외 모델의 대부분은 이러한 내피 세포의 이동, 증식과 생존 2,3 등 혈관의 기본 단계를 재현하기 위해 설계되었습니다. 자주 생체 분석에 사용되는이 있지만 t, 리겔 행렬에 내피 세포의 분기 네트워크의 형성이다자신은 내피 세포의 특정 아니며, 일반적으로 혈관 주위 세포 나 평활근 세포의 지원을 통합 않습니다. 이러한 배아 신체 분석, 대동맥 링 분석 및 태아 중족골 분석으로 마우스 오르간 문화를 사용하여 전직 생체 돋아 혈관의 평가는 추가 지원 세포의 맥락에서 내피 세포의 혈관 신생의 분석을 할 수 있습니다. 그러나 이러한 분석의 주요 한계 분석을 위해 제한된 창을주고, 혈액 흐름의 부족으로 시간이 지남에 혈관의 회귀 (가) 있습니다. 따라서, 더 정확하게 혈관 신생의 조절을 이해하고, 생체 내 모델뿐만 아니라 뒷다리 허혈 모델로, 같은 피하 이식 스폰지 또는 Matrigel의 플러그를 사용하여 마우스를 개발 한 것과 필요합니다. 그러나 이러한 모델은 neovessels의 복잡한 3 차원 구조에 의한 분석하기 위해 도전하고 있습니다. 반면에, 제브라 피쉬 배아 전체에 시각화 혈관을위한 훌륭한 모델을 입증했다생물 4. 그러나 마우스는 마우스 많은 경우에 선호하는 모델을 만들고, 진화 훨씬 더 밀접하게 제브라보다 인간에 관한 것입니다. 따라서 출생 후 마우스 망막의 혈관은 혈관 연구를위한 선택의 잘 특성화 방법을 나타냅니다. 그것은 생리적 설정뿐만 아니라 쉽게 적절한 형광 얼룩을 사용하여 시각화 할 수있는 2D 혈관 얼기도 제공한다. 혈관 네트워크 내피 세포 증식, 발아​​, 혈관 주위 세포의 모집 및 혈관 리모델링의 구조는이 모든 기술을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 신생아 마우스 망막, 망막 혈관의 발달은 출생 인생의 첫 주에 발생합니다. 마우스는 인간과는 달리, 블라인드 태어나 망막은 출생 후 혈관됩니다. 망막 혈관이 출생 후의 일 0 (P0)에서 시신경 망막 주변의 중앙에서 발생하고, 매우 조직 형성하는 혈관에 의해 개발약 P8 5에 의해 망막 주변부에 도달 D 혈관 신경 얼기. 혈관은 모세 혈관 따위가 점차 개입 모세관 네트워크 동맥과 정맥의 정기 교류 패턴을 생성하는 주변을 향해 광학 디스크에서 바깥쪽으로 성장 특성 방식으로 개발할 수 있습니다. 망막 혈관 따라서 비교적 쉽게 평면 마운트 준비 5 망막 혈관을 검사하고, 그들은 본질적으로 2D 평면 무엇에 성장 혈관이 쉽게 식별 할 수있는 혈관을 연구하는 이상적인 모델을 제공합니다. 몇 시간 전 생체에 내피 팁 세포 반응의 분석을 위해 마우스 신생아 망막을 분리하는 방법은 6보고되었습니다. 또한, 전체 망막 혈관과 관련 혈관 마커에 대한 자세한 조사 개발의 다른 단계에서 고정 망막 표본의 면역 염색이 필요합니다. 여기에 우리가 제공하는우리는 현미경으로 최종 이미지에 얼룩 프로토콜을 통해 (도 7 참조) 출생 후 아이의 초기 적출술에서 쥐 망막 혈관 신경 얼기의 전체 마운트 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 곧장 앞으로 방법에 대한 자세한 설명.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 3 ml</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>PIP4210</td>
			<td>Remove tip with scissors to create a wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 24-well plates</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>353226</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Petri dishes TV 90 mm</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1336</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td>Used for enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal clear' tubes 2 ml</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1420-2000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make up in 2x PBS and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Detects astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>04-585</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Detects vascular basement membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Detects vascular smooth muscle cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550546</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550548</td>
			<td>Detects endothelial cell junctions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alk1 (goat polyclonal)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF770</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Secondary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11058</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRc</td>
			<td>Camera for dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioimager with Apotome</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRm</td>
			<td>Camera for Axioimager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 발아에 의해 정의 된 새로운 혈관 형성의 복잡한 과정이다. 혈관 신생은 암, 실명 및 허혈성 질환 등의 혈관 형성 dysregulated되는 많은 질병, 또한뿐만 아니라 장기 및 조직의 정상적인 발달에 중요한 역할을하지만. 혈관 질병에 특히 새로운 혈관 형성을 시도하고 조절하는 새로운 약물 개발을위한 중요한 목표 그래서 성인 생활에, 혈관은 일반적으로 정지합니다. 더 나은 혈관을 이해하고이를 조절하는 적절한 전략을 개발하기 위해 모델은 정확하게 관련된 다른 생물학적 단계를 반영해야합니다. 동맥, 정맥 및 모세 혈관이 출생 후 첫 주 동안 혈관 신경 얼기를 형성하기 위해 개발 때문에 마우스 신생아 망막 혈관의 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한이 모델은 두 디를 갖는 장점이있다mensional (2D) 구조는 다른 혈관 네트워크의 복잡한 3D 해부학에 비해 간단하게 분석을하고. 출생 후 다른 시간에 망막 혈관 신경 얼기를 분석하여, 그것은 현미경으로 혈관의 여러 단계를 관찰 할 수 있습니다. 이 문서 isolectin 혈관 특정 항체와 형광 염색법을 사용하여 마우스 망막의 혈관을 분석 간단한 절차를 보여줍니다.

절개 후 망막 평면 꽃 (그림 1)과 같다. 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 내피 세포는 안티 - 알파 평활근 액틴 (그림 2)를 사용하여 시각화하는 isolectin B4-Alexa488 염색을 사용하여 혈관 근육 세포를 지원 볼 수 있습니다. 그림 2에서 5 배 목표를 사용하여 저전력보기는 망막의 혈관 조직의 개요를 할 수 있습니다. 또한, 위의 프로토콜에 주어진 항체의 다른 조...

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Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을 제공합니다<em&gt; 생체 내</em&gt; 컨텍스트. 정확하게 혈관 신경 얼기를 시각화하는 면역 형광 염색 연구의 이러한 유형의 성공에 필수적이다.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

45.4K 조회수.  Newcastle University. 신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을 제공합니다 생체 내 컨텍스트. 정확하게 혈관 신경 얼기를 시각화하는 면역 형광 염색 연구의 이러한 유형의 성공에 필수적이다.

비디오: Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

연구

신경과학

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 전체 마운트 염색, 시각화 및 분석

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...