저자 지원 TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE - 0098-00)와 NIH R21CA152473 감사드립니다.

1. 셀 심는 <ol><li> 세포가 overconfluency로 성장하는 것을 허용하지 않습니다. 기본 셀을 transfecting 때 초기 통로 세포를 사용합니다. </li><li> transfection하기 전에 24 시간 정도, 세포를 trypsinize hemocytometer를 사용하여 세포 수를 계산하고, 원하는 세포 밀도 (세포 / 볼륨)를 달성하기위한 매체와 세포 현탁액을 희석. 명확한 조직에 종자 세포는 저수지와 다중 채널 피펫을 사용하여 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 문화 취급. 선택한 밀도는 transfection 당일 confluency 70~80%를 제공해야합니다. 표 1에 표시로 예를 들어, 셀은 여기에 표시 transfection 데이터를 25-50 셀 / μl로 희석되었다. </li></ol> 2. 세포 Transfection <ol><li> 폴리머와 DNA 주식의 희석. 실온 (RT)에서 폴리머와 DNA 주식 솔루션을 해동. 12 채널 피펫을 사용하여 명확 96 - 웰 플레이트에서 별도로 폴리머 주식 솔루션과 DNA 주식 솔루션을 희석, DNA 중량 비율 (중량 / 중량)에 원하는 폴리머 무게를 얻기 위해 필요한 농도에 해당 용매를 갖추고 있습니다. 이 경우, 선택된 용매는 25 MM 나트륨 아세테이트 버퍼 (산도 = 5.2)입니다. <ol><li> DNA 희석. 일반적으로, 1 MG / ML에 저장된 DNA가 아닌 조직 문화 취급 분명 96 - 웰 플레이트 (단일 제제에 대한 잘 하나)의 0.03-0.06 MG / ML의 농도에 나트륨 아세테이트 버퍼에 희석되어 있습니다. 표 2 쇼 1 단계의 세포를 놓는 96 - 웰 플레이트에 모두 복제 우물을 transfect하는 데 사용되는 단일 제제에 대한 일반적인 DNA 희석 프로토콜. </li><li> 폴리머 희석. 100 MG / ML 폴리머 / DMSO 솔루션은 DNA 중량 / 중량 비율로 원하는 폴리머를 얻기 위해 필요한 농도에 따라 아세트산 나트륨 버퍼에 희석되어 있습니다. 일반적으로 폴리 (베타 - 아미노 에스테르) S (PBAEs)와 유전자 전달에 사용되는 중량 / 중량 비율의 범위은 20 100입니다. PBAE의 폴리머 먼저 희석 P에 이어, 10 MG / ML에 희석 아르rotocol는 표 3에 표시. 폴리머 dilutions는 DNA 희석 판의 샘플 방향을 일치하지 않는 조직 문화 취급 분명 96 - 웰 플레이트에서 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Nanoparticle 형성. 12 채널 피펫을 사용하여 플라스미드 DNA 솔루션의 동일한 볼륨에 PBAE 솔루션을 추가하고 힘차게 섞는다. 자기 조립을 허용하는 10 분 동안 RT에서 혼합 배양합시다. </li><li> Nanoparticle의 transfection. 자기 조립 후, 20 μl 나노 입자는 12 채널 피펫을 사용하여 문화 매체 dropwise에 따라 잘 추가됩니다. 복제 우물이 치료 남아 있습니다 또는 컨트롤과 같은 상업적으로 이용 가능한 시약으로 transfected 수 있습니다. transfected 세포는 37 incubated 아르 ° 2-4시간 한 다음 우물에 대한 C는 신선한 미디어 (100 μl / 잘)로 대체됩니다. 부화 시간의 선택은 세포 라인, 문화 조건 및 transfection 시스템에 따라 달라집니다. transfection의 차이잠복기가 변화의 결과로 효율성과 세포 독성은 3 단계에 설명 된 분석 프로토콜에 의해 정량화 될 것입니다. </li></ol> 3. Transfection의 효율성 세포 독성 분석 Transfection 효율은 형광 현미경으로 시각적 분석과 흐름 cytometer 사십팔시간 후 transfection을 사용하여 정량하고 있습니다. 세포 독성은 형광 현미경으로 시각적으로 분석 CellTiter 96 수성 한 검정 이십사시간 후 transfection을 사용하여 정량하고 있습니다. <ol><li> 형광 현미경. 시각적으로 적절한 형광 채널을 사용하여 transfected 리포터 유전자 (예를 들어, EGFP 또는 DsRed)의 표현을위한 우물을 분석 할 수 있습니다. 적절하게 특정 공법 (그림 1)의 transfection 효율을 나타내는 뷰의 필드를 선택, 각도에 대한 이미지를 취득. 시각적으로 관찰하는 세포 독성을 적어 둡니다. </li><li> 유동 세포 계측법. <ol><li> 유동 세포 계측법의 96 - 웰 플레이트를 준비하는 다중 채널 피펫을 사용합니다. PBS로 씻어, μl / 잘 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 30, 가장자리 등의 각 우물에, 170 μl FACS 버퍼 (PBS + 2% FBS)와 피펫을 중화 아래로 trypsinize, 그리고 전체 200 μl 볼륨을 전송 둥근 바닥이나 V-하단에 96도 판에 해당 우물에 각도. </li><li> 4에서 5 분 130 XG에서 판을 원심 분리기 ° C. </li><li> 거품을 피하면서 각 resuspend을 잘하고 피펫 세포로부터 170 μl 미디어를 제거합니다. 각도에; 가능성이 propidium의 요오드화물 (PI) 같은 얼룩을 사용하려면, FACS 버퍼 + PI (PI 주식 농도 1 MG / ML PI 희석 50:1 FACS 버퍼) 10 μl를 추가합니다. 즉시 얼음에 넣고 빛으로부터 다룹니다. </li><li> C6 Accuri 흐름 cytometer, 96 - 웰 첨부 파일 HyperCyt하고 HyperView 소프트웨어를 시작합니다. 적절한 P를 선택합니다 HyperView 디자인 및 프로토콜 탭을 사용하여후반 유형, 판 레이아웃, 그리고 셰이크 / 한모금과 같은 다른 설정은 / 린스 / 시간을 잡아 봐요. 위의 프로토콜은 다음 매개 변수는 한 분, 2,400 rpm에서 30 초 동안 미리 판 흔들림에 대해 미리 판 프라임을 사용했다. 십 시간이 15 rpm으로 15 초에 설정 한 탐사선이 2 초에 잘 때마다 씻어, 그리고는 간뿐만 2,400 rpm으로 12 초 동안 매 12 우물을 흔들. 간 잘 흔들림은 세포가 우물 그룹 사이의 시간이 초과되었습니다 나누기를 (이 경우 12 초)을 포함하여 데이터를 처리 할 수​​있는 능력 향상을 위해뿐만 아니라, 미디어에 분산 보관하는 것이 중요합니다. </li><li> 적절한 아니라 (그림 2)에 데이터를 별도의를 처리 할 HyperView 잘 확인 탭을 사용하십시오. 개인 우물을 식별하기 위해, 그것은 소프트웨어의 노이즈 필터뿐만 아니라 고급 설정에서도 필터 기준을 포함​​하여 사용하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 다른 팝업을 구분하기 위해 적절한 게이팅에 의해 긍정적으로 transfected 라이브 세포의 비율을 수량화ulations (그림 3). 첫 번째 파편 (그림 3A)에서 별도의 셀에 위해 FSC 대 SSC 분산 형 플롯에 흐름 데이터를 볼 수 있습니다. propidium의 요오드화물 (PI)가 사용 된 경우, 게이트 개별 세포 인구 전망이 FSC 대 FL3 플롯에 대한 데이터 죽은 세포 및 게이트 라이브 세포에서 라이브 세포를 분리하는 순서를 유지해야합니다. transfected 세포의 수를 수량화하기 위해, 해당 채널에서 라이브 셀 인구를 보려면 예를 들어, GFP는 FL1에서 볼 수 있습니다. 문은 배경 신호 (그림 3B)을 식별하기 위해 치료 인구를 치료 세포 사용합니다. 긍정적 transfected 세포는 다음이 게이트를 사용하여 분리 분산 및 윤곽 플롯 (그림 3C 및 3D)을 모두 사용하여 transfected 인구를 보면. 할 수 있습니다 다른 세포가 형광의 다른 도로 transfected 될 것 같은 긍정적 transfected 세포의 연속이있을 수 있습니다. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 수성 한 분석 <ol><li> 세포 독성 측정이 정확히 같은 방식으로 다른 판을 Transfect. </li><li> 10 ML 신선한 매체와 CellTiter 96 수성 한 분석 솔루션의 Premix 1 ML. 세포에서 미디어를 제거하고 premixed 솔루션의 110 μl + 잘 당 미디어를 추가 할 채널 피펫을 사용합니다. </li><li> 치료 상태와 잘의 흡광도는 분석의 선형 범위에서 될 때까지 490 nm의 1에서 4 시간까지 1 시간 간격으로 흡광도를 측정합니다. 배경 흡광도 읽기에 대해서만 솔루션 + 미디어 4 개의 제어 우물을 포함합니다. </li><li> 평균 흡광도 조건에 따라 네 개의 복제 우물의 값을 각각 평균​​에서 평균 배경 흡광도를 뺍니다. %의 세포 생존 능력을 결정하는 치료 조건의 수정 평균 각 처리 조건에 대한 수정 평균을 정상화. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. Nanoparticle은 NTA와 플라스미드 당 입자의 계산과 크기 조정 <ol><li> 약 1/5th의 최대 속도와 최대 속도 약 1/10th에서 뒤로 샘플 펌프에서 앞으로 희석제 펌프를 실행하여 Nanosight의 NS500의 주요 fluidics 시스템입니다. fluidics 시스템이 희석제로 플러시 될 때까지 계속합니다. </li><li> 분석 할 수있는 나노 입자를 준비합니다. PBAEs의 경우, 별도로 주식 플라스미드 DNA (1 MG / ML)와 Eppendorf 튜브에 아세트산 나트륨 버퍼의 주식 PBAE를 (100 MG / ML) (25 MM, 산도 5) 희석. </li><li> 0.06 MG / ML에 플라스미드 DNA 농도를 희석. 폴리머 농도가 DNA에 폴리머의 필요한 무게 중량 비율에 따라 달라질 수 (60 중량 / 중량 입자에 대한 예를 들어, 폴리머는 3.6 MG / ML에 희석합니다.) </li><li> 플라스미드 DNA 솔루션의 동일한 볼륨에 폴리머 솔루션을 추가하고 힘차게 섞는다. 자기 조립을 허용하도록 10 분 동안 실온에서 혼합을 품다. </li><li> 디류트 nanoparticle 농도 위해서는 100 배 PBS로 nanoparticle 솔루션은 NTA에 해당하는 범위에하고 적어도 500 μl의 최종 볼륨을 얻을 수 있습니다. </li><li> 샘플 Eppendorf 튜브 (그림 4A)에로드 관을 배치하여 Nanosight에 샘플을로드합니다. 공기 거품을 소개하지 있는지 확인하십시오. </li><li> 입자을 볼 수있을 때까지 캡처 모드에서 카메라 수준을 향상시킬 수 있습니다. 입자 (그림 4A 및 4B) 부드러운 볼 수 있도록 초점을 조정합니다. </li><li> 일반 모드에서 모든 입자가 화면에 볼 수 있다는 점을 통과 카메라 수준을 조정합니다. 그런 다음 입자가 모든 여전히 관찰 할 수 있도록 가장 낮은 수준에 카메라 수준을 낮출 수 있습니다. 중간 카메라 수준이 필요한 경우, 고급 모드로 가서 카메라 셔터를 수정하고 적절한 수준으로 파악할 수 있습니다. </li><li> 시각 20 사이에있을 것 확인 - s의 100 입자를creen. nanoparticle 추적을위한 이상적인 숫자는 약 50 입자입니다. 너무 많은 또는 너무 적은 경우, NS500를 플러시 PBS로 희석을 조정하고, 샘플을 다시로드합니다. </li><li> 표준 모드 표에 따라 촬영 시간을 조정합니다. 일반적으로 30-60 초는 적절한 캡처 길이 (그림 4B)입니다. </li><li> 다음 샘플을로드하려면 다시로드하여 새 샘플 다음, 시스템을 플러시. </li><li> 일단 동영상을 캡처, 비디오 파일을 열어 처리 단계로 진행합니다. </li><li> 가장 (그림 4C) 비디오를 처리하기 위해 조정 할 수 있습니다 매개 변수의 숫자가 있습니다. 목표는 최선의 각 입자 (그림 5)를 통해 화면에 적십자 마크가 표시된 화면에서 각 입자를 캡처하는 매개 변수를 선택하는 것입니다. </li><li> 더 나은 입자를 보려면 화면 이득을 향상시킬 수 있습니다. 표준 또는 고급 모드에서 자동으로 clickin하여 매개 변수에 대한 조정을 선택g 해당 상자. 자동 설정이 적절하게 입자를 선택하지 않습니다 경우, unclick 상자 수동으로 매개 변수를 (그림 4C)을 설정합니다. </li><li> 일단 모든 입자가 화면에 선택됩니다, 비디오 파일 (그림 4C)를 처리하는 소프트웨어의 프로세스 버튼을 클릭합니다. 이것은 입자 크기 분포, 크기의 평균뿐만 아니라, 입자 농도를 제공합니다. </li><li> 입자 농도가 정확 특정하기 위해서, 배에 희석을 증가하여 PBS 희석 같은 변경하고, 위의 절차를 반복합니다. 동일한 샘플의 여러 dilutions을 측정하는 것은 샘플의 농도 측정이 정확한지 확인하는 것이 좋습니다. 측정을위한 좋은 범위는 10 7 -10 9 입자 / ML입니다. </li><li> 모든 plasmids은 나노 입자의 젤 전기 영동을 실행하고 무료로 DNA가 존재 여부를 평가함으로써 나노 입자에 포함되어 있는지 확인합니다.모든 plasmids를 캡슐화하는 경우, 총 캡슐화 plasmids을 수량화하기 위해 DNA의 흡광도를 측정하는 표준 기술을 사용합니다. </li><li> 입자 당 plasmids의 평균 수를 계산하려면 NTA 측정 입자 농도에 의한 총 캡슐화 플라스미드 농도를 나눕니다. 플라스미드 당 입자 샘플 분포를 추정하기 위해, 먼저 입자의 각 1 나노 미터 빈의 볼륨 분율을 계산하는 NTA 입자 크기 히스토그램을 사용합니다. 각 병원에 plasmids의 수를 얻기 위해 전체 플라스미드 금액하여이 볼륨 분율 분포를 곱합니다. 각 입자 크기 (그림 6)에 대한 plasmids 당 입자의 수를 얻기 위해 각 빈에있는 입자의 수가이 숫자를 나눕니다. </li></ol>

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저자는 관심의 충돌을보고하지 않습니다.

위의 프로토콜 nanoparticle 공법의 transfection 효율뿐만 아니라 입자 크기와 나노 입자의 DNA 로딩을 특성화 할 수있는 방법을 평가하는 방법을 설명합니다. 입자 당 plasmids의 수는 입자의 효과를 예측 할 수 있습니다 중요한 매개 변수이며, 또한 용량 결정에 사용할 수 있습니다. Nanoparticle 추적 분석 등 소금 농도에 차이가있는 등 다양한 수성 솔루션의 범위에서 수행 할 수 있습니다. 종종이 특성은 생...

nanoparticle 당 complexed plasmids의 수의 결정은 특히 동일한 셀 대상에 대해 여러 plasmids의 공동 제공을위한 효과적인 nanoparticle 기반의 유전자 전달 전략을 설계,하는 것이 중요합니다, 등은 종종 연구 12 재 프로그래밍 줄기 세포에 필요합니다. 하나의 nanoparticle과 관련된 plasmids의 수를 계산하는 몇 가지 방법이 설명, 각 접근 방식은 추정 13-16에 사용되는 기술의 단점을 가지고있다되었습니다. TEM과 결합 양자 점 (QD) 라벨은 키토산 기반의 나노 입자에 입자 당 plasmids를 추정하는 데 사용되었습니다. 캡슐화 라벨이없는 DNA가 직접 감지되지 않는 가능성; 잠재적으로 중복 plasmids과 입자의 2D TEM 이미지에서 QDs,이 QD 기술을 추정 인해 그 자체 조립 속성을 변경할 수있는 DNA를 레이블 할 필요에 복잡하고 다른 단순화 가정 13. 이 대안 접근 방식pplicable 주문 microdomains의 입자에 존재하면 cryo - 전송 전자 현미경 (cryo-TEM), X-선 산란, 및 동적 광 분산 (DL을) 14,15을 통해 Lipopolyamine-DNA 단지를 연구하는 데 사용되었습니다. 불행하게도, 이러한 여기 조사 고분자 나노 입자 등의 자료는이 방법으로 적용되지 않습니다. . 그러나, 그들의 방법은 큰, 마이크론 크기의 입자 16 평가할 수 있습니다, 또 다른 연구에서, 콜린스 외 공부하는 흐름 입자 이미지 분석 기술 (LYS) 16 - 포함 펩타이드 / DNA 복합체를 사용했습니다. 따라서, 우리는 최근에 nanoparticle 11 당 plasmids의 수를 수량화 할 수있는 소설하고 유연한 분석을 개발했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 인산염은 1X (PBS)를 식염 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 10,010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV의 BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Invitrogen </td><td> 25,300 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 아세테이트 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S7899 </td><td> 탈 이온수에 25mM로 희석 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> 엘림의 Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21,718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, 분기 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 408727 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 수성 하나 </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 자료 </td></tr><tr><td> 삭제 평면 바닥 96 - 웰 플레이트, 무균 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> 삭제 둥근 바닥 96 - 웰 플레이트, 무균 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 채널 Finnpipette </td><td> 열 과학 </td><td> NA </td><td> 5-50과 50-300 μl </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> 모델 번호 : AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri 흐름 cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt 첨부 </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> Nanosight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

고분자 나노 입자를 사용하여 비 바이러스 성 유전자 전달은 유전 질환 1을 치료하는 유전자 치료에 대한 매력적인 접근 방식으로서 재생 의료 2 기술로 등장했다. 중요한 안전 문제가 바이러스, 달리, 고분자 나노 입자는 더 큰 핵산화물과 생분해 성 및 / 또는 환경 대응을 들고 할 수있는, 화학적으로 다양한, 합성 무독성, 비 immunogenic, 비 mutagenic, 쉽게 할 수 있도록 설계 할 수 있습니다. 양이온 폴리머는 일반적으로 고분자 나노 입자를 칭했다 아르 100 나노 미터의 순서에 복합체를 형성하기 위해 정전기 상호 작용을 통해 부정적인 요금이 부과 DNA와 자기 조립. nanoscale polycationic 유전자 전달 나노 입자를 형성하는 데 사용 biomaterials의 예로는 비 degradable 재고품입니다 polylysine, polyphosphoesters, 폴리 (amidoamines) s와 polyethylenimine (PEI)를 포함 일반적으로 핵산 전달 1,3에 사용되는 양이온 폴리머. 폴리 (베타 - 아미노에스테르) S (PBAEs)는 5,6 hydrolytically degradable이며, 인간의 망막 내피 세포 (HRECs) 7과 같은 어려운 transfect 세포 유형에 대한 유전자 전달에 효율적으로 표시되어 양이온 폴리머 4의 최신 수업 마우스 유방 상피 세포 8, 인간의 뇌 암 세포 9 및 10 macrovascular (인간 배꼽 정맥, HUVECs) 내피 세포. nanoparticle 추적 분석 (NTA)를 활용 한 고분자 나노 입자를 특성화 할 수있는 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법에서 입자 크기 분포와 입자 당 plasmids의 수 분포 모두 11 얻을 수 있습니다. 또한, 고분자 나노 입자의 transfection 효율의 급속한 진단을위한 높은 처리량 96 - 웰 플레이트 transfection 분석이 제공됩니다. 이 프로토콜에서는 폴리 (베타 - 아미노 에스테르) S (PBAEs)이 모델 고분자와 인간 망막 내피 세포 (HRECs)로 사용되는은 MO로 사용됩니다델 인간의 세포. 이 프로토콜은 쉽게 고분자 nanoparticle 및 멀티뿐만 판 형식에 대한 관심의 세포 유형을 평가하도록 구성 할 수 있습니다.

그림 1은 플라스미드 EGFP와 HRECs를 성공적으로 transfection의 예를 형광 현미경 이미지를 보여줍니다. brightfield 이미지는 세포가 자신의 일반적인 형태를 유지하도록 도움이됩니다. 또한, 이러한 MTS 또는 이와 유사한 assays 같은 세포 생존 능력의 assays은, nanoparticle 독성 7 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 설명 된대로, transfection 효율을 수량화하는 데 사용할 ?...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.8K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine. nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다....

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Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Nanoprecipitation 기법을 통해 디블록 고분자 Nanoparticles의 제형

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

연구

생체공학

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

조합의 합성과 고분자 필름과 Nanoparticle 도서관에서 높은 처리량 단백질 출시

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

포토 리소그래피에 의해 고분자 미세 바늘 어레이 제작

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

실크 나노 입자의 제조 및 약물 전달 응용 프로그램

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

고분자 나노 입자에 소수 성 및 친수성 화합물의 캡슐화에 대 한 NanoPrecipitation 플래시

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Methods Article

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자