이 프로토콜을 사용하면 세포병증 효과에 의존하지 않고 지카 바이러스를 식별하고 정량화할 수 있습니다. 바이러스 성분의 항체 인식에 달려 있습니다. 바이러스 특이적 항체를 사용하면 혼합된 집단에서 다양한 바이러스 혈청형을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 방법은 기존의 플라크 형성 분석에 비해 장점이 있습니다. 빠른 세포 계수를 위해 자동 이미징 시스템과 함께 적용할 때 더 빠르고 처리량이 많은 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 제안된 프로토콜은 적응력이 뛰어납니다.
적절한 수정을 통해 제안된 프로토콜은 다양한 세포 유형 및 바이러스 표적에 적용될 수 있습니다. 10% FBS와 2밀리몰의 L-글루타민이 보충된 12밀리리터의 DMEM이 포함된 75제곱=센티미터 세포 배양 플라스크에서 Vero 세포를 성장시키는 것으로 시작합니다. 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
세포 단층을 감염시키려면 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. 5밀리리터의 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크를 3밀리리터의 DPBS로 두 번 헹굽니다. 다음으로, 무혈청 DMEM 2mL와 Zika 바이러스 접종물 20mL를 세포 배양 플라스크에 넣습니다.
플라스크를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 바이러스 흡착을 촉진합니다. 배양이 끝나면 5밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 희석된 바이러스 접종물을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 세포 배양 플라스크를 3mL의 DPBS로 두 번 헹굽니다.
그런 다음 세포 배양 플라스크에 12mL의 유지 배지를 추가하여 감염된 세포를 유지합니다. 감염된 Vero 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 세포 배양 인큐베이터에서 3일 동안 배양합니다. 3일간의 배양 후 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 지카 바이러스가 포함된 세포 배양 상층액을 50밀리리터 원심분리 튜브에 수확합니다.
바이러스 정량을 위해 Vero 세포를 지정된 접시에 파종하고 5% 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 밤새 자라도록 합니다. 각 플레이트에 대해 6개의 멸균 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하여 음성 대조군을 위한 추가 튜브를 포함하여 10배 연속 희석을 수행합니다. 24웰 플레이트 설정의 경우 6개의 마이크로 원심분리기 튜브 모두에 450마이크로리터의 무혈청 DMEM을 추가합니다.
96웰 플레이트 설정의 경우 135마이크로리터의 무혈청 DMEM을 6개의 추가 튜브에 분주합니다. 24웰 플레이트 실험에 대한 연속 희석을 수행하려면 50마이크로리터의 지카 바이러스 스톡을 450마이크로리터의 무혈청 DMEM이 들어 있는 10-마이너스 튜브에 추가합니다. 96웰 플레이트 실험의 경우, 135마이크로리터의 무혈청 DMEM이 들어 있는 튜브 1개에 15마이크로리터의 지카 바이러스 스톡을 추가합니다.
각 튜브를 소용돌이쳐 바이러스와 배지를 완전히 혼합하여 희석 내에서 바이러스 입자가 고르게 분포되도록 합니다. 새 피펫 팁을 사용하여 10-마이너스 1개의 튜브를 재현탁하고 50-15마이크로리터의 희석된 지카 바이러스를 10-마이너스 2개의 튜브에 각각 24웰 및 96웰 플레이트에 대한 두 번째 10배 희석액으로 옮깁니다. 적절한 플레이트의 각 웰에 대한 상태 배지를 제거하고 폐기하십시오.
DPBS로 각각을 두 번 잘 헹구어 잔여물을 제거합니다. 가장 높은 희석액부터 시작하여 연속적으로 희석된 바이러스 접종물을 웰에 추가하여 가장 낮은 희석액을 향해 작업합니다. 1시간 배양 후 가장 낮은 농도부터 가장 높은 농도까지 웰에서 바이러스 현탁액을 제거하고 폐기합니다.
감염된 세포를 DPBS로 두 번 씻어 바이러스 현탁액의 흔적을 제거합니다. DMEM과 1.5% 저점도 카르복시메틸셀룰로오스로 웰을 오버레이합니다. 이산화탄소 5%가 있는 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
배양 후 오버레이 배지를 제거하고 폐기하고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 96웰 플레이트의 경우 멀티채널 피펫을 사용하여 오버레이 배지를 제거 및 폐기하고 웰당 60마이크로리터의 PBS로 셀을 세 번 세척합니다. 4%의 파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정하고 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.
20분 후 파라포름알데히드를 버리고 PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 다음으로, 3, 3'디아미노벤지딘 퍼옥시다제 기질을 첨가하고 어두운 곳에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 30 분 후 우물을 물로 씻어 반응을 중지하십시오.
플레이트를 밤새 자연 건조시키고 초점 계수를 진행합니다. 선택한 희석액의 각 반복실험에 대한 병아리를 계산하고 각각에 대한 평균 병소 수를 계산합니다. 감염된 Vero 세포는 감염 후 다른 시점에서 고정되었습니다.
2-웰 플레이트의 경우, 바이러스 병소의 첫 출현은 감염 후 48시간 후에 관찰되었지만, 병소 크기가 너무 작아서 정확하게 계산할 수 없었습니다. 감염 후 96시간이 지나도 세포 분리의 징후는 없었다. 감염 후 60시간이 지났을 때, 병소 크기는 계수를 위한 최적의 수준으로 증가했습니다.
그 후, 시간이 지남에 따라 초점이 커지고 강도가 서로 합쳐지거나 겹치기 시작하여 시간이 지남에 따라 성장하는 클러스터를 형성했습니다. 따라서 감염 후 60시간 후에 형성된 병소를 선택하여 24웰 플레이트에서 지카 바이러스 역가를 측정했습니다. 96웰 플레이트의 경우, 감염 후 72시간 후에도 세포가 온전하게 유지되었습니다.
바이러스 병소의 출현은 감염 후 24시간 후에 처음 관찰되었습니다. 그러나 감염 후 최대 36시간까지는 병소 크기가 너무 작았습니다. 최적의 병소 크기는 감염 후 48시간에 달성되었습니다.
후자의 시점에서는 겹치거나 병합된 초점이 관찰되었고, 겹쳐진 초점의 수는 시간이 지남에 따라 증가했다. 감염 후 48시간 후에 형성된 병소는 지카 바이러스 분리체의 바이러스 역가를 결정하기 위해 선택되었습니다. 각 웰의 측면에 DPBS를 부드럽게 추가하고 플레이트를 앞뒤로 1-3회 흔들어 세포 파편과 과도한 매체를 제거합니다.
이 기술은 지카 연구 연구자들에게 큰 도움이 될 것이며, 임상적으로 중요한 다른 바이러스를 정량화하는 데에도 광범위하게 적용될 수 있어 바이러스 감시 및 진단에 유용한 도구가 될 것입니다.
