이 방법은 숙주 아미노 반응에 관여하는 코딩, 비코딩 및 바이러스 RNA 발현뿐만 아니라 병원체가 숙주의 생물학적 기능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 검사함으로써 숙주 병원체 상호 작용연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 단일 전혈 샘플에서 글로빈 감소 된 RNAeq 라이브러리에서 mRNA 및 비 코딩 RNA의 처리에 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 이 기술을 시연하는 것은 제 실험실의 기술자인 사라 앤더슨(Sarah Anderson)이 될 것입니다.
실온에서 10분 동안 50 20회 G에서 혈액튜브를 원심분리하는 것으로 시작합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서 작업한 후 상퍼를 제거한 후 8밀리리터의 RNase 없는 물을 펠릿에 추가합니다. 튜브를 닫고 펠릿이 눈에 띄게 용해될 때까지 펠릿을 소용돌이게 한 다음 실온에서 10 분 동안 50 20 회 G에서 튜브를 원심 분리하여 펠릿을 복구합니다.
생물학적 안전 캐비닛에서 작업, 상체를 폐기하고 펠릿을 저장합니다. 총 RNA를 분리하려면, 펠릿에 리시스 결합 버퍼의 300 마이크로 리터를 파이펫팅으로 시작합니다. 소용돌이 후, 새로운 라벨1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 각 튜브에서 혼합물을 전송.
miRNA 격리 키트에서 30 마이크로리터의 균질 첨가제를 추가합니다. 튜브를 소용돌이치며 얼음 위에 10분 간 놓습니다. 연기 후드에서 작업, 얼음에서 튜브를 제거하고 키트와 소용돌이에서 산 페놀 클로로폼 시약의 300 마이크로 리터를 추가하여 혼합합니다.
실온에서 5분 동안 10, 000회 G에서 원심분리한 후, 새로운 튜브에 수상으로 조심스럽게 제거합니다. 이전 단계에서 수성 회복의 양을 기준으로, 혼합각 튜브 및 파이펫의 수성 파지에 100%에탄올의 1.25 배의 부피를 추가합니다. 각 샘플에 대해 필터 카트리지가 포함된 신선한 수집 튜브를 준비합니다.
파이펫 약 675 마이크로리터의 용액-에탄올 혼합물을 필터 카트리지에. 원심분리기는 10, 000회 G에서 간단히 원심분리기를 사용하여 필터를 통해 액체를 전달합니다. 흐름을 삭제합니다.
용액 에탄올 혼합물을 필터와 원심분리에 추가하여 완전히 사용될 때까지 반복합니다. 키트에서 필터 카트리지에 700 마이크로리터의 워시 솔루션을 추가합니다. 원심분리기는 필터를 통해 솔루션을 간단히 가져옵니다.
흐름을 버리고 동일한 필터 카트리지와 수집 튜브를 유지합니다. 각 필터 카트리지에 500 마이크로리터의 워시 솔루션 2-3을 추가합니다. 원심분리 후 흐름을 버리고 세척 단계를 반복합니다.
필터 카트리지에서 잔류 액체를 제거하려면 60초 더 회전합니다. 카트리지를 신선한 수집 튜브로 옮기습니다. 각 필터 카트리지의 중앙에 95도 예열된 뉴클레아제 없는 물의 100마이크로리터를 추가합니다.
최대 속도로 탁상 원심분리기에서 약 20~30초 동안 카트리지를 원심분리합니다. 글로빈 환원 올리고스를 사용하여 혼성화를 발효시키기 위해, 먼저 추출된 각 샘플을 0.2 밀리리터 얇은 벽핵반응튜브에 첨가하여 RNA를 분해한다. 튜브를 열 사이클러에 70°C의 70도에서 2분간 배치합니다.
그 후, 즉시 최적의 RNA 품질을 얻기 위해 얼음에 튜브를 배치합니다. 튜브가 냉각되는 동안, 2 밀리리터 튜브에 10X 글로빈 감소 올리고 믹스와 10X 올리고 혼성화 버퍼의 400 마이크로리터를 준비합니다. 혼성화 믹스를 만들기 위해, RNA 샘플 6 마이크로그램, 10X 글로빈 환원 올리고 믹스의 마이크로리터 2개, 10X 올리고 혼성화 완충제의 1마이크로리터, 뉴클레아제 프리 워터를 각각 0.2 밀리리터 박벽, 뉴클레아스 프리 반응 튜브에 10 마이크로리터의 최종 부피에 추가한다.
튜브를 열 사이클러에 70°C의 섭씨 70도에 2분간 놓습니다. 그 후, 즉시 얼음에 튜브를 배치합니다. RNase H 소화를 수행하려면 먼저 10X RNase H를 하나의 X RNase H 버퍼로 1개의 X RNase H로 희석합니다.
10X RNase 버퍼의 마이크로리터 2개, RNase 억제제 1편, X RNase H 1개 소리터 2개, 뉴클레아제 없는 물의 5마이크로리터를 총 10마이크로리터에 결합하여 RNase H 반응 혼합을 준비한다. RNase H 반응 믹스의 10 마이크로리터를 글로빈 감소 혼성화 샘플에 추가하고 철저히 혼합합니다. 이 반응을 섭씨 37도에서 10분간 소화한 다음 섭씨 4도까지 식힙니다.
튜브에 0.5 개의 어금니 EDTA의 마이크로 리터 1개를 추가하여 소화를 멈추고 튜브의 전체 함량을 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 그 직후, RNase 가 없는 물 80마이크로리터, 350마이크로리터의 용해 완충제, 각 튜브에 100% 에탄올 250마이크로리터를 넣고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 각 700 마이크로리터 샘플을 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 별도의 용출 필터 카트리지로 전송하여 유동을 수집합니다.
원심분리기는 8, 000배 이상에서 15초 동안 원심분리기를 한 다음 흐름을 폐기합니다. 동일한 용출 필터 카트리지를 새로운 2밀리리터 수집 튜브에 넣습니다. 필터 카트리지 멤브레인을 세척하려면 필터 카트리지와 원심분리기 500마이크로리터를 8, 000배 이상에서 15초 간 추가합니다.
흐름을 삭제합니다. 그런 다음 동일한 수집 튜브를 사용하여 필터 카트리지에 80%에탄올의 500 마이크로리터를 추가합니다. 8, 000 배 G에서 2 분 동안 원심 분리기 및 더 큰.
흐름 통과 및 수집 튜브를 모두 폐기하고 용출 스핀 컬럼을 저장합니다. 각 용출 스핀 컬럼을 새로운 2밀리리터 컬렉션 튜브에 넣습니다. 필터 카트리지의 열린 뚜껑을 통해 5분간 전속력의 원심분리기는 스핀 컬럼 멤브레인을 건조시키고 에탄올 이월을 방지합니다.
수집 튜브를 폐기한 후 말린 필터 카트리지를 1.5밀리리터 수집 튜브에 넣습니다. 필터 카트리지 멤브레인의 중앙에 직접 RNase가 없는 물 14마이크로리터를 추가합니다. RNA를 elute하기 위하여는, 최고 속도로 60 초 동안 관을 원심분리하고 추가 RNA 평가 및 준비로 계속합니다.
글로빈 고갈된 시료는 이제 분할되어 작은 비코딩 RNA 라이브러리뿐만 아니라 리보 고갈된 mRNA 및 길고 비코딩 RNA 라이브러리를 준비하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜을 사용하여 글로빈 고갈 및 리보 고갈된 전혈 샘플의 발현 라이브러리를 준비한 후, 전기 포근 파일 실행 요약은 6.3에서 9.2까지 범위의 RNA 무결성 번호를 가진 글로빈 고갈 된 라이브러리 샘플을 보여 주었다. 이것은 글로빈 고갈 방법을 사용하고 단지 6에 가까운 RIN 숫자를 달성할 수 있었다 그밖 연구 결과에 비해 개선된 것으로 판명되었습니다.
단일 돼지 전혈 샘플의 사전 글로빈 감소 및 글로빈 후 감소는 260 에서 280 나노미터 농도 비율이 2 개 이상임을 보여주었다. 이 프로토콜을 사용하여, 풀링 및 시퀀싱 전에 글로빈 및 리보 고갈된 전혈 mRNA 라이브러리 샘플의 칩 기반 전기페로그램이 얻어졌다. mRNA 라이브러리의 경우, 대표적인 전기 페로그램은 약 280개의 베이스 쌍에서 피크를 갖는다.
작은 ncRNA 대표 칩 기반 전기 페로그램은 약 100에서 400 베이스 쌍까지 의 피크의 범위를 포함한다. 약 143개의 베이스 쌍의 피크는 miRNAs에 해당하며, 약 153개의 베이스 쌍의 피크는 piRNAs에 해당합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 지적 된 즉시 얼음 튜브를 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 다음 세대 염기서열 분석과 같은 그밖 방법은 차동 표현, 후성 유전학 변경 및 생물학 통로 및 프로세스에 그 효력과 같은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행되어야 합니다. 페놀 클로로폼 시약으로 작업하는 것은 매우 위험하며 연기 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오. 또한, 전혈 또는 전염성 유기체를 취급할 때, 전염하는 유기체의 활성화의 앞에 생물학적 안전 캐비닛에서 작동을 수행해야 합니다.
