우리의 프로토콜은 장기적인 오가노이드 유지에 효과적인 것으로 입증된 여러 기술을 결합했습니다. 이것은 임상 증상이 발달 기간을 벗어난 노화 관련 질병의 노화를 연구하는 데 유용합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 특수 장비나 시약이 필요하지 않다는 것입니다.
실험실에서 흔히 볼 수 있는 재료를 기반으로 합니다. 노화 및 신경퇴행성 질환은 우리의 현재 모델링 방법이 초기 발달 단계보다는 확립된 질병 표현형에 주로 초점을 맞추기 때문에 특별한 관심 대상이 되었습니다. 배아 줄기 세포와 iPSC는 매우 섬세한 세포입니다.
처음 사용하는 사용자는 온화하고 인내심을 가져야 합니다. 이들은 장기 배양이기 때문에 처음부터 인내심을 가져야합니다 시작하려면 봉합사 가닥에 70 % 에탄올을 뿌리고 메스의 뭉툭한 끝으로 봉합사 가닥을 닳게하여 PLGA 마이크로 필라멘트를 준비하십시오. 섬유를 현미경으로 관찰합니다.
그리고 자를 사용하여 섬유를 500마이크로미터에서 1밀리미터 길이의 가닥 조각으로 자르기 시작합니다. 총 약 25 밀리미터의 섬유를 자르고 1 밀리리터의 항생제 - 항진균 용액이 들어있는 15 밀리리터 튜브에 필라멘트를 첨가하십시오. 다음으로 후드에서 섬유 용액을 10밀리리터의 DMEM/F-12로 희석하고 잘 섞이도록 합니다.
이어서, 20 마이크로리터의 섬유 용액을 96-웰 플레이트의 3개의 웰에 첨가한다. 명시야 현미경을 사용하여 웰당 섬유를 계수하고 평균을 구합니다. 웰 당 평균 5 내지 10 마이크로필라멘트가 되도록 섬유 용액으로 웰을 희석하거나 농축한다.
이전에 배양된 유도만능줄기세포가 70-80%의 밀도에 도달하면 현미경으로 세포를 10배 또는 20배 배율로 확인합니다. 콜로니가 자발적인 분화 면적의 10% 미만을 나타내는지 확인합니다. 피펫으로 배지를 흡인하고 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다.
그런 다음 500 마이크로 리터의 세포 분리 용액 또는 0.5 밀리몰 EDTA를 첨가하여 콜로니를 해리시키고 섭씨 37도에서 3-5 분 동안 배양합니다. 다음으로, 1밀리리터의 새로운 E8 배지를 각 웰에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 모든 세포를 분리합니다. 전체 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 1 밀리리터의 새로운 E8 배지를 추가합니다.
이어서, 실온에서 3분 동안 290g의 세포를 스핀 다운시킨다. 상청액을 버린 후, 50 마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 E6 배지 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. ROCK 억제제가 보충된 E6 배지에서 원하는 착석 밀도의 세포 현탁액을 준비한다.
이어서, 150 마이크로리터의 세포 현탁액을 96-웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 다음으로, 플레이트를 290 g에서 실온에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 강제로 응집시켰다. 그런 다음 배아체 형성을 위해 5% 이산화탄소로 가습된 분위기에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
24시간 배양 후, 플레이트를 후드로 옮기고 피펫 팁을 웰 안으로 너무 멀리 내려 배아체를 흡인하지 않도록 주의하면서 피펫을 사용하여 배지 120마이크로리터를 조심스럽게 흡인합니다. 다음으로, 2개의 마이크로몰 XAV939 및 SMAD 억제제로 보충된 150 마이크로리터의 신선한 E6 배지를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 다시 인큐베이터로 옮기고 억제제가 보충 된 새로 준비된 E6로 매일 배지를 교체하십시오.
배양 7일째에 모든 배아체가 직경 550-600마이크로미터에 도달했는지 확인하고 매끄럽고 투명한 가장자리를 표시합니다. 이 단계에서, 그들은 세포 외 기질에 내장 될 준비가되었습니다. 오가노이드를 내장하려면 빈 P200 상자에 4인치 길이의 열가소성 천장 필름 시트를 놓아 딤플 임베딩 시트를 준비합니다.
그런 다음 15 밀리리터 원추형 튜브 또는 500 마이크로 리터 마이크로 원심 분리기 튜브를 사용하고 필름 시트를 구멍에 부드럽게 눌러 12 개 또는 원하는 수의 딤플을 만듭니다. 다음으로 필름 시트에 70% 에탄올을 뿌리고 UV 라이트를 켠 상태에서 후드 내부를 최소 30분 동안 건조시킵니다. 한편, 충분한 양의 기저막 매트릭스를 얼음 위에서 해동합니다.
그런 다음 넓은 보어 P200 팁을 사용하여 96웰 플레이트에서 각 딤플로 하나의 배아체를 옮깁니다. 일반 피펫 팁으로 가능한 한 많은 배지를 제거하되 배아체를 건조시키지 마십시오. 다음으로, 일반 사전 냉각 P200 팁을 사용하여 약 30마이크로리터의 희석되지 않은 막 매트릭스를 각 오가노이드에 추가하여 배아체가 액적의 중심에 최대한 가깝도록 합니다.
모든 배아체가 매트릭스에 묻히면 필름 시트를 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 페트리 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 가습된 분위기에서 10분 동안 배양하여 멤브레인 매트릭스가 응고되도록 합니다. 오가노이드 분화를 위해 비타민 A가 없는 B-27로 준비된 분화 배지 5밀리리터를 초저 부착 6웰 플레이트의 한 웰에 추가합니다.
인큐베이터에서 접시를 섭씨 37도까지 예열하십시오. 멤브레인 매트릭스가 응고되면 필름 시트 뒷면에서 딤플을 밀어내어 내장된 배아체를 6웰 플레이트로 옮깁니다. 필요한 경우 우물에서 1 밀리리터의 매체를 사용하고 시트에 씹어 필름 시트에서 물방울을 분리합니다.
막 기질에 내장된 배아체는 대뇌 오가노이드로 분화되어 시험관 내에서 매일 뚜렷한 발아 형성을 나타냅니다 10. 시험관 내 30일째에 오가노이드는 딤플 또는 샌드위치 임베딩을 사용하여 추가로 성숙됩니다. 장기간의 배양은 대뇌 오가노이드가 상당한 크기로 성장했음을 보여줍니다.
시험관 내 7일째에 배아체는 SOX2 양성 신경 로제트, 흩어져 있는 미성숙 뉴런 및 신경 전구 세포를 표시합니다. 반면 시험관 내 120에서는 MAP2 및 NeuN과 같은 성숙한 신경 마커를 나타냅니다. 이러한 세포골격 마커는 더블코르틴 및 시냅신과 같은 다른 유사분열 후 마커와 함께 사용하여 시냅스 가소성 및 기타 노화 관련 감소뿐만 아니라 성상교세포 및 신경교세포와 같은 추가 뇌 조직을 조사할 수 있습니다.
조직의 가장자리가 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 유해한 전단력을 최소화하려면 예를 들어 매체 및 오가노이드 임베딩을 교체하는 동안 배관을 천천히 수행해야 합니다. 오가노이드 성장이 느려지면 초기 세포 발현에서 질병의 진행을 연구할 수 있습니다.
오가노이드 생성은 많은 질병 치료에서 조기 발견의 길을 열어줍니다.
