이 작품은 미국 심장 협회 (AYS로 포스트 박사 교제)와 국립 보건원 (MH085499, EB003832 및 OD006831 디케이까지)에 의해 지원되었다. 우리는 원고에 대한 의견에 대해 베스 프리드먼과 파블로 무계획 감사드립니다.

1. 수술 준비하기 전 <ol><li> 초음파 세척기의 Maxizyme, 외과 우유의 혼합물에 sonicating하여 수술 도구를 청소합니다. 각 실험 전에 수술 도구를 압력솥. </li><li> 필요한 모든 시약과 disposables를 사용할 수 있는지 확인합니다. 시약 및 disposables의 목록은 표 2에 제공됩니다. 가능하면 노출된 조직과 접촉 시약 및 disposables는 살균해야합니다. </li><li> 마취를 유도. 생존 연구에 적합한 일반 anesthetics는 표 1에 설명되어 있습니다. 발가락 핀치 반사의 부족으로 확인하여 마취의 수술 비행기를 확인합니다. 마우스의 최적의 나이는 생후 3-6주입니다. 어린 생쥐의 두개골은 부드럽고 얇은 더 어렵습니다. 이전 마우스는 벗겨 절차를 수행하는 동안 더 피를 봐야 두꺼운 두개골이 있습니다. </li><li> stereotaxic 프레임 1에서 동물을 고정합니다. 수술 장비의 목록은 표 2에 제공됩니다. </li><li> 몸의 온도를 유지37 진짜야 ° C에서 피드백 규제 직장 프로브 및 열 패드를 사용합니다. </li><li> 수분을 유지하기 위해 눈에 안과 연고를 바릅니다. </li><li> 작은 전기 면도기로 머리를 면도. </li><li> 70% (V / V) 이소 프로필 알콜과 함께 보라고 뒤에 Betadine로 두피를 청소합니다. </li><li> 원하는 경우 심장과 호흡 속도는 펄스 산소 농도계를 사용하여 정상 범위 내에 있는지 확인하십시오. 마우스, 숫자는 각각 약 10 센터와 2 Hz에서해야합니다. </li><li> 37 ° C (125 MM NaCl, 10 MM 포도당, 10 밀리미터 HEPES, 3.1 MM CaCl 2, 1.3 밀리미터 MgCl 2, 산도 7.4) (시그마에서 모든 화학 물질)로 멸균-필터링된 인공 대뇌 척수 (ACSF)의 나누어지는을 따뜻하게 2. </li></ol> 2. 헤드 프레임 마운트 <ol><li> 포셉, 외과 가위로 전체 지느러미 두개골 표면을 통해 두피를 제거합니다. 두개골 및 게시물의 양쪽에 laterally 측두엽 근육의 가장자리에 피부 손질목 (그림 1A)의 근육에 erior. </li><li> 두개골의 표면에서 얇은 골막을 제거 메스 블레이드를 사용하십시오. </li><li> 젖은 솜으로 두개골을 청소 작은 주걱을 끌어내려하고 먼지 수에서 공기의 흐름으로 두개골 표면을 건조. 그런 다음 전체 두개골 표면 cyanoacrylate 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다. 접착제가 완전히 건조하도록 허용합니다. 접착제의이 계층은 후속 단계에서 치과 시멘트의 적절한 준수가 필요합니다. cyanoacrylate 접착제는 소독을 할 필요가 없습니다. </li><li> 멀리 원하는 창의 영역에서 두개골 표면에 금속 커넥터를 연결합니다. anesthetized 준비 들면, 작은 너트는 나중에 볼트를 사용하여 이미지 설정 (그림의 1B, 1L와 1N)으로 망하는 수 cyanoacrylate 접착제의 명인과 두개골을 확보할 수 있습니다. 접착제가 두개골에 첨부하는 동안 스레드를 입력하지 않도록 테이프로 너트의 뒷부분을 밀봉합니다. 너트와 테이프은 멸균 처리 해야해<html> 이전 수술에 의한 autoclaving. </li><li> 깨어 이미징 준비를 위해 두 개의 첨부 지점 (그림 1M와 1N)으로보다 엄격한 정의 커넥터를 연결합니다. ½ mm 드릴 버와 contralateral 피질 반구 위에 두개골에 구멍을 뚫을 및 후 두 # 000 셀프 태핑 나사를 소개합니다. 이러한 나사는 머리 두개골에 마운트 정박하는 데 도움이됩니다. 기본 피질에 압력을 적용하지 않도록하기 위해, 나사의 한 차례를 적용합니다. 그런 다음, 소뇌 이상 cyanoacrylate 접착제의 작은 소량으로 정의 금속 크로스 모음을 첨부합니다. cyanoacrylate 접착제가 완전히 건조하도록 허용합니다. 이 금속 커넥터는 크게 자유의 학위를 감소시키고 길이 방향의 연구에 동일한 이미징 분야의 재배치를 단순화합니다. 넓은 크로스 바는 vibrissae의 전극 배치 및 자극을위한 충분한 공간을 제공합니다. 사용자 정의 헤드 마운트 및 첨부 장치를 생성하는 상세한 계획은 온라인에서 구할 수 있습니다 (그를 이길 / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). 나사와 크로스 바 전에 수술에 autoclaving 소독을해야합니다. </li><li> 치과 시멘트의 계층과 윈도우의 위치 (그림 1C 및 1D) 제외, 전체 두개골 표면을 커버. 피부의 모든 노출된 가장자리는 시멘트로 덮여 있는지 확인하십시오. 치과 시멘트의 구성 요소는 멸균 처리하지 않아도됩니다. </li></ol> 3. 번쩍의 생성 및 Thinned-해골 (포트) 창 강화 <ol><li> 드릴 털은 날카로운 것을 확인하고이를 재사용하지 마십시오. ½ mm 버와 somatosensory 피질 이상 2mm 지역으로 2mm 얇은 치과 훈련에 낮은 속도를 사용합니다. 냉각을위한 땀 및 썼음을위한 건조, ACSF으로 두개골을 wetting 후 가스 살포기에서 공기의 부드러운 흐름으로 두개골 표면을 건조 사이의 대체. 이것은 과다 출혈 있습니다 두개골의 해면 모양의 계층을 통해 썼음 필요하지만 controll 수ACSF (그림 1E)으로 세정하여 에드. 두개골은 ~ 50 μm의이며, pial 혈관이 젖었 뼈 (그림 1 층)를 통해 볼 수있을 때 훈련의 약간의 압력을 받고 굽히는 시작한다. 이 두께에서는 뼈 사이 작은 흰 반점이 건조 두개골 표면이 moistened되는 직후 몇 초간 표시가됩니다. </li><li> 이 시점에서, 뼈를 얇은 더욱. 단지 약간의 터치와 함께 두개골 표면을 미는 느린 훈련 속도, 즉, 1000 RPM을 사용하십시오. 펜처럼 훈련을 누른 상태에서 작은 움직임 제어를 사용하고 오직 측면 방향으로 힘을 적용됩니다. 뼈가 최종 두께 (그림 1G)에서 10-15 μm의를 낙제야해야합니다. 건조 두개골 표면이 moistened 때 뼈를 충분히 얇은되면 뼈에 작은 흰 반점은 더 이상 볼 수 없습니다. </li><li> 주석 산화물 분말과 윈도우 영역을 갈고 닦아서. 실리콘 수족관 밀봉 재와 함께 담근되어 미리 만든 드릴 비트를 첨부테이퍼 채찍을 (삽입된 페이지, 그림. 1H) 떠나, 그린. 실리콘 채찍은 수술 전에 최소한 하나의 하루를 준비하고 사용하기 전에 이소프로판올 70%로 소독해야한다. ACSF (그림 1H)의 방울과 함께 창을 분말의 작은 핀치를 놓습니다. 부드럽게 두개골 표면으로 이동 채찍의 끝을 만져 의해 10 분 동안 창문을 통해 슬러리를 선동. ACSF를 사용하여 창문에서 철저하게 주석 산화물 분말을 멀리 플러시와 공기의 부드러운 흐름과 함께 철저하게 뼈를 건조. 이전 단계에서 드릴링으로 남아 표면 불규칙과 자기편 골 칩은 연마 (그림 1H와 1I) 이후에 제거하여야한다. 주석 산화물 분말은 멸균 처리하지 않아도됩니다. </li><li> 노 평방 조각을 잘라. 윈도우의 크기보다 약간 작은 공 덮개 유리. 부드럽게 스트레이트 에지를 사용하여 커버 슬립으로 구분하여 수평 및 수직 라인을 득점하는 학자를 사용합니다. 그렇다면 배양 접시와 KN에서 커버 슬립을 배치유리 조각을 분리하기 위해 테이블​​ 가장자리로부터 요리를 ock. 전체 배양 접시 그런 다음 불임을 보장하기 위해 autoclaved 수 있습니다. </li><li> 적절한 규모의 커버 유리 근처 말린 창을 놓습니다. 부러진 나무 목화 팁 작은 주걱의 끝부분을 사용하여 창을 통해 cyanoacrylate 접착제의 작은 소량을 적용하고, 신속하게 접착제 꼭대기 커버 유리 precut 조각을 밀어. 커버 유리 밑에 거품을 생성하지 마십시오. 부드럽게 두개골 표면에 대한 커버 유리를 밀고하고, 몇 초 (그림 1J 및 1O)을 누르고 있습니다. 접착제 15 분 이상 완전히 건조하도록 허용합니다. 그것이 건조 후 초과 cyanoacrylate 접착제는 메스 블레이드로 커버 유리의 위쪽 표면에서 제거할 수 있습니다. 치과용 시멘트와 커버 유리의 가장자리를 밀봉하고 형성 약간 마른 렌즈 (그림의 1K 및 1O)에 물을 잡고 잘 키웠습니다. </li></ol> 4. 회복 <ol><li> 따뜻한 케이지 다음과 같은 수술에 동물을 배치합니다. 을 모니터링동물은 정기적으로 그것은 완전히 마취에서 회복까지. </li><li> 준비가 하루 이상 생존하기위한 경우 진통제에 대한 buprenorphine을 (G의 설치류 당 0.03 μg)을 제공합니다. 초기 주입 후 우리는 일반적으로 이미지 동물 적어도 하나의 하루. </li></ol> 5. 이미징 준비 <ol><li> 머리 지원 (그림 1L와 1M)와 같은 프레임을 사용하여 이미징을위한 광학 브레드 보드에 동물을 안정화. 구속 장치는 Qioptiq 또는 ThorLabs에서 상용 optomechanical 구성 요소로 만들 수 있습니다. 각자의 접시는 동물과 하나의 단위 3로 조립된 모든 생리적 모니터링 장치와 외과와 두 광자 이미징 스위트 사이에 옮겨질 수 있습니다. </li><li> 혈액 흐름 이미징이 원하는 경우 5 % 0.05 ML (W / V) 형광등-dextran 염료는 혈액 혈청 (그림 2A와 2C 2 시간에 레이블을 지정하는 두 꼬리 정맥 또는 infraorbital 정맥을 통해 무균 식염수에 용해 투입 </strong&gt;) 4-7. 이것은 전신 마취하에 수행되어야합니다. dextran 솔루션보다 점성만큼 Infraorbital 정맥 관리는 초보자를 위해 쉽게있을 수 있습니다. 꼬리 정맥은 어두운 색의 생쥐에서 찾을 어려울 수 있으며, 정맥은 실패 주사 후 축소하는 경향이있다. 녹색 발광과 이미징 vasculature 들어, 플루오레신 isothiocyanate dextran을 사용합니다. 붉은 방출 들면, 텍사스 레드 dextran을 사용합니다. 높은 분자량의 dextrans으로 염료는 여러 시간 동안 순환에 남아 있습니다. 또는 내생 형광 레이블과 동물은 적절한 두 광자 여기 파장에 직접 몇 군데하실 수 있습니다. dextran 솔루션은 나중에 사용할 수 aliquots 동안 얼어있을 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 젖은 솜으로 윈도우 표면을 청소하는 것은 작은 주걱 줬지. </li><li> anesthetized 준비 장시간 이미징 들어, 체액 및 에너지 요구 사항을 유지하기 위해 g 2 시간마다 당 3 μL의 볼륨에서 멸균 lactated 울리는의 솔루션 intraperitoneally을 주입. &lt;/ 리&gt; <li> 언제 깨어있는 상태에서 이미징 동물, 스트레스 수준을 줄이기 위해 한 번에 몇 시간에 머리 구속을 제한하고 있습니다. 음식과 물을위한 이미징 세션 사이의 홈 새장에 동물을 반환합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 성공 창이 몇 달 동안 pial 표면 아래 250 μm의로 이미징 깊이를 최대 수 있습니다. 이 방법은 대뇌 피질의 실질 팔 안에 생체내 모세관 혈액의 흐름 4, 8, microglial 활성화 8, 9, 돌기 구조를 공부하는 데 사용되었습니다. 한 예로, 우리는 혈액 혈청은 텍사스 레드 dextran (그림 2A)의 정맥 주사에 의해 표시된 후, anesthetized Thy1 - 노란색 형광 단백질 (YFP) 마우스의 대뇌 피질 vasculature을 보여 두 광자 이미징을 사용합니다. Dural 혈관은 종종 약간 경질의 mater에서 대뇌 피질의 표면 (그림 2C, 화살표) 위에서 볼 수 있습니다. 대형 pial arterioles 및 venules 리대뇌 피질의 표면에 전자 (그림 2D). 그들은 대뇌 피질의 조직에 영양을줍니다 고밀도 모세관 침대 (그림의 2E까지 2 시간)으로 가지를 내다 피질로이 표면 네트워크 및 다이빙에서 관통 혈관 지점. 대뇌 피질의 뉴런을 표현 깊은 YFP이 마우스 라인에 신호 내생의 돌기 arbors는 두 번째 채널 10 (그림 2B 2 시간까지)에 동시에 몇 군데하실 수 있습니다. 뼈의 두 번째 고조파 신호 3이 채널에 수집되고, 이미지 스택의 수집 후 thinned 두개골 (2C에 그림의 2A)의 두께를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 두피 혈관 역학은 심히 anesthetics 11 시까지 영향을받습니다. 두 번째 예제에서, 우리는 길들여지지 깨어 마우스에서 두 개의 광자 현미경에 의해 수집된 자발 vasoactivity의 동영상을 보여줍니다. 루멘 직경 유명 vasomotor의 oscillations는 pial arteriole로 보지 아니지만 이웃 venule으로하고 있습니다. 이vasoactivity의 기초 범위는 우레탄 마취의 4 줄어들 수 있습니다. 혈액 흐름의 자연과 evoked 변화를 계량하기 위해 우리는 각 혈관의 혈관 직경과 적혈구 속도를 모두 캡처하는 적응 라인 스캔 기법을 사용합니다. 두 광자 현미경을 사용하여 정량 혈액 흐름 이미징에 대한 자세한 자료는, 12 3 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> 1 그림. 포트 윈도우를위한 절차. 포트 윈도우를 생성하기위한 절차의 순차적 단계 (에 K) 이미지. 자세한 지침은 텍스트를 참조하십시오. β = bregma와 λ = 람다. anesthetized 준비 이미징 동안 머리 보안을위한 (L) 볼트 및 너트 시스템. (M) 정의 깨어 준비를위한 크로스 바 헤드 마운트를 가공. 이 예제에서는 커넥터도 반복 electrocorticogram 녹음을 위해 이식되었다. (N)도식 다이어그램은 헤드 마운트 및 다양한 구성 요소의 위치 지느러미 전망을 보여주고 있습니다. 패널 L에 사용되는 너트는 패널 M. 두에서 사용하는 크로스 바에 대한 대안으로 의미 # 000 셀프 태핑 나사 것은 깨어 이미징 준비와 추가된 안정성을위한 크로스 바 장착으로 추가됩니다. 포트 윈도우의 단면을 보여주는 (O) 도식 다이어그램. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 피질의 vasculature과의 연결 구조의 2 광자 영상. 모든 이미지는 윈도우 주입 10시 이일에 Thy1-YFP 마우스에서 포트 창문을 통해 수집되었다. vasculature ()과 dendrites (B)와 관련 thinned 두개골을 보여주는 코로나 방향으로 조직을 150 μm의 이상 최대한의 투영. 뼈 (파란색)가 900 나노미터 여기에 450 nm의 방출에서 두 번째 고조파 형광을 수집하여 감지되었습니다 <sup&gt; 8. vasculature (적색)을 정맥 주사 70 kDa 텍사스 레드 dextran 6 시까지로 분류되었다. 뉴런의 돌기 분야 (녹색) Thy1-YFP 유전자 변형 마우스 라인 내생 있습니다. PIA 아래 서로 다른 깊이에서 수평 방향으로 조직의 50 μm의 이상 (CH) 최대한의 전망. 데이터 패널에 표시된 동일한 이미지 스택 출신 A와 B Dural 혈관 막 대뇌 피질의 표면 (C에서 화살표) 위에서 볼 수 있습니다. 약어 ACSF은 = 인공 대뇌 척수 포트 = 광택 및 철근 thinned 두개골 창 YFP은 = 노란색 형광 단백질 제가 설명한 절차가 현지 기관 동물 케어에 의해 승인되었다는 확인하고위원회를 사용하십시오.

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공개하는 아무것도.

두 광자 포트 창을 통해 영상은 레이저 빛을 attenuates하고 더 깊이 8 시에 광학 aberrations을 추가 thinned 뼈 및 경질 통해 전송을 필요로합니다. 그러나이 단점에도 불구하고 최대 pial 표면 아래 250 μm의에 이미징 깊이는 900 nm의 여기를 구현할 수 있습니다. 그레이터 이미징 깊이는 원칙적으로 13 이상 여기 파장과 수도 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 완전한 craniotomy 14, 15과</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 대리인 </td><td> 인도의 루트 </td><td> 마우스에 대한 선량 </td><td> 존속 기간 </td><td> 노트 </td><td> 출처 </td><td> 심판 심판 </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 μg / g </td><td> 15-60 분 </td><td> 좁은 여유가 없다. 천천히 마취의 적절한 복용량까지 작동합니다. 필요에 따라 유도 선량의 10 %를 보완. </td><td> 036093; 버틀러 Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 케타민을 (Ketaset)는 Xylazine (Anased) 섞인 </td><td> IP </td><td> 60 μg / G (K) 10 μg / g (X) (동일 주사기에 혼합) </td><td> 20-30 분 </td><td> Xylazine는 근육 이완 및 진통제로 공동 주입된다. 필요에 따라 유도 선량의 50 %에서만 케타민을 보완. </td><td> (K) 010177, (X) 033,198; 버틀러 Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Isoflurane (Isothesia) </td><td> 흡입 </td><td> 4 % 유도를위한 폐포 농도 (MAC)을 의미, 유지 보수 1-2% MAC </td><td> 4-6 H. </td><td> 70 % 산소 30 % 질소 산화물의 혼합물로 제공. 장시간 마취 회복을 늦추기 위해 이끌고 있습니다. </td><td> 029403; 버틀러 Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> 표 1. 생존 공부를 마취 요원을 제안했습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> ITEM </td><td> 회사 </td><td><stroNG&gt; 카탈로그 # / 모델 </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 6,906,950 </td></tr><tr><td> Buprenorphine (Buprenex) </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 031,919 </td></tr><tr><td> 플루오레신 isothiocyanate dextran, 2 MDA 분자량 </td><td> 시그마 </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> 이소 프로필 알코올 </td><td> 어부 </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Lactated 울리는의 솔루션 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> Lidocaine 용액, 2 % (V / V) </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 002,468 </td></tr><tr><td> 식염 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 009,861 </td></tr><tr><td> 외과 우유 </td><td> 버틀러 Schein </td><td&gt; 014,325 </td></tr><tr><td> 텍사스 레드 dextran, 70 kDa 분자량 </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 035,646 </td></tr><tr><td> DISPOSABLES </td></tr><tr><td> 초경 털은, 1 / 2mm 팁 크기 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Cottoned 팁 applicators </td><td> 피셔 과학 </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> 유리, 아니 보호해. 0 두께 </td><td> 토마스 과학 </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylate 접착제 </td><td> ND 산업 </td><td> 31,428 H04308 </td></tr><tr><td> 가스 살포기 </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> 그립 시멘트 분말 </td><td> Dentsply </td><td> 675,571 </td></tr><tr><td> 그립 시멘트 용매 </td><td> Dentsply </td><td> 675,572 </td></tr><tr><td> 인슐린 주사기, 29.5 게이지 바늘로 0.3 ML 볼륨 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 018,384 </td></tr><tr><td> 너트와 머리를 고정 볼트 </td><td> Digikey </td><td> 너트, H723-ND, 볼트, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Opthalmic 연고 </td><td> 버틀러 Schein </td><td> 039,886 </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> 나사, 셀프 태핑 # 000 </td><td> JI 모리스 회사 </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> 실리콘 수족관 밀봉 재 </td><td> 완벽 제조 </td><td> 31,001 </td></tr><tr><td> 주석 산화물 분말 </td><td> 엄마의 광물 </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> 장비 </td></tr><tr><td> 유리 학자 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> 현미경 해부 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> 전기 파워 드릴 </td><td> Foredom 또는 Osada </td><td> K.1020 (Foredom) 또는 EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> 전기 면도기 </td><td> Wahl </td><td> 시리즈 8900 </td></tr><tr><td> 집게, 뒤몽 안돼. 55 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> 피드백 조절 열 패드 </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (직장 써미스터, 40 - 90 5D-02, H) 패드, 40-90-2-07 먹어 </td></tr><tr><td> Isoflurane 기화기 </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> 펄스 산소 농도계 </td><td> 스타 생명 과학 </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> 미니어처, 드라이버 </td><td> 가렛 웨이드 </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Stereotaxic 프레임 </td><td> Kopf 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 900 (마우스 마취 마스크와 비 파열 귀에 바 있음) </td></tr><tr><td> 외과 가위, 무딘 끝 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> 초음파 세척기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약, disposables 및 장비 목록.

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

생체내에서는 대뇌 피질 기능의 영상은 intracranial 환경의 방해없이 뇌로 광 액세스가 필요합니다. 우리는 직경 몇 mm에 걸쳐 그리고 수 개월 동안 안정 마우스 두개골에 광택과 철근 thinned 두개골 (포트) 윈도우를 구성하는 방법을 제시한다. 두개골이 광학 선명도를 달성하는 훈련을 실​​시 손으로 두께 10-15 μm의에 thinned하고 있으며, 다음으로 cyanoacrylate 접착제와 덮개 유리로 중첩됩니다 : 1) 강성, 2를 제공하는 것은) 뼈 regrowth을 억제하고 3) 빛의 산란을 감소 뼈 표면에 부정에서. 두개골이 터진 않았으므로, 공부중인 프로세스에 영향을 미칠 수있는 염증이 크게 줄어 듭니다. 최대 대뇌 피질의 표면 아래 250 μm의로의 이미징 깊이는 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 창문은 잘 anesthetized 정신 모두 준비에서 대뇌 혈류와 세포 기능을 공부하기 적합합니다. 그것은 더 이상 작전을 제공합니다portunity는 optogenetics를 사용하여 세포의 활동을 조작하거나 photosensitizers 순환의 조사의 대상이 혈관의 혈액 흐름을 방해한다.

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A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K 조회수.  University of California, San Diego. 우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

연구

신경과학

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Reconsolidation 창 동안 멸종 교육은 두려움의 복구를 방지

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

에 얇게 - 두개골 두피 창 기술<em&gt; 생체 내</em&gt; 광 결맞음 단층 촬영 영상

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...