NET은 최근 주목을 받고 있지만 생체 내에서 NET을 정량화하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 임상 환경에서 NET의 특성을 조사하기 위한 바람직하고 매우 민감하며 가치 있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 패혈증 또는 패혈성 ARDS의 중증도, 급성 호흡 곤란 증후군을 평가하기 위해 확장되어야 합니다.
덤프 또는 손상 관련 분자 패턴을 조절하는 것이 패혈증의 임상 상태를 개선하는 열쇠라는 것이 널리 받아들여지고 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 골수과산화효소-DNA 및 호중구 엘라스타제-DNA와 같은 순환하는 NET 잔여물을 단시간에 정확하게 정량화하는 것입니다. 분석 전에 샘플을 회전시키고 반복적인 해동을 피하는 것이 좋습니다.
프로토콜에 주어진 잠복기를 따르는 것이 중요합니다. 갓 분리된 다형핵 호중구를 페놀 레드가 없는 RPMI 1640에서 밀리리터당 10, 000 세포로 희석하는 것으로 시작하십시오. 35 밀리미터 배양 접시에 체로 치십시오.
호중구 세포외 트랩 또는 NET을 유도하려면 먼저 25나노몰 PMA로 다형핵 호중구를 자극합니다. 이어서, DNase I의 밀리리터 당 0.6 마이크로그램을 첨가하여 세포외 트랩을 부분적으로 소화시키고, 혼합물을 실온에서 50분 동안 인큐베이션한다. 이제 5밀리몰 EDTA를 추가하여 DNase 활성을 중지하고 합성된 NET이 포함된 배지를 수집합니다.
세포 파편을 제거하기 위해 원심 분리기. 4개의 건강한 대조군에서 상층액을 수집합니다. 믹스 추가 사용을 위해 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
0.05 마이크로 그램의 항체를 함유 한 희석 된 항 -골수과산화 효소 100 마이크로 리터를 ELISA 플레이트에 피펫으로 넣습니다. 이제 시료 증발을 방지하기 위해 접착식 플라스틱 덮개로 플레이트를 덮고 섭씨 4도에서 밤새 시료를 배양하여 포획 항체가 결합할 수 있도록 합니다. 다음날, 희석된 항체 용액을 웰로부터 버리고, 300 마이크로리터의 세척 용액을 각각의 웰에 피펫팅한다.
종이 타월로 접시를 두드려 물기를 제거하여 여분의 PBS를 제거합니다. 플레이트의 각 웰을 200 마이크로리터의 블로킹 완충액으로 블로킹한다. 접착 플라스틱 덮개로 덮고 부화하여 우물을 막습니다.
우물에서 차단 용액을 버리고 플레이트를 3-4 번 세척 한 후 종이 타월로 두드려 말립니다. 다음으로, 블랭크를 제외한 모든 웰에 25 마이크로리터의 혈장을 피펫팅한다. 이를 75 마이크로리터의 PBS로 희석하여, 최종 웰 부피를 100 마이크로리터로 만든다.
그런 다음 블랭크 웰에 100 마이크로 리터의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 250rpm으로 10초 동안 진탕기에 올려놓음으로써 샘플을 혼합한다. 100 완전히 희석된 DNase I 2마이크로리터를 모든 웰에 첨가하고, 밀봉된 플레이트를 10초 동안 쉐이커에 올려 샘플을 완전히 혼합한다.
실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 각 웰에 1마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 첨가하여 DNase 반응을 중지시킨다. 그런 다음 밀봉된 플레이트를 셰이커에 15초 동안 올려 샘플을 완전히 혼합합니다.
마지막으로, 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 NET의 단백질 성분이 포획 항체에 부착되도록 합니다. 다음날, 우물에서 용액을 버리십시오. 여러 웰 세척 후, 희석된 퍼옥시다아제 접합 항-DNA 검출 항체 100 마이크로리터를 각 웰에 피펫팅한다.
플레이트를 1 1/2 시간 동안 배양 한 다음 용액을 웰에 버립니다. 웰을 3회 세척한 후, 100 마이크로리터의 ABTS 기질 용액을 각 웰 내로 피펫팅하고, 밀봉된 플레이트를 암실에서 진탕기 상에서 인큐베이션한다. 50 마이크로 리터의 2 몰 황산을 첨가하여 반응을 중지하십시오.
접시 측면을 조심스럽게 두드려 우물 내용물을 섞습니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어 응용 프로그램을 시작합니다. 상태 표시줄에서 새 실험을 만들고 이름을 지정합니다.
그런 다음 Absorbance를 판독 유형으로, Endpoint를 판독 모드로, two를 파장으로 선택하여 플레이트 판독 파라미터를 설정합니다. 다음으로 람다 1을 405 나노 미터로, 람다 2를 490 나노 미터로 설정합니다. 이제 AutoCalibration을 On으로 유지하면서 Automix와 Blanking 모두에 대해 Off 상태를 선택합니다.그런 다음 Strips에서 Read entire plate를 선택합니다.
마지막으로 Normal(보통)을 Carriage Speed(캐리지 속도)로 Column Wavelength Priority(열 파장 우선 순위)를 설정한 다음 AutoRead(자동 읽기)에서 Off(끄기)를 선택합니다. 플레이트를 악기 서랍에 잘 넣고 닫습니다. 읽기를 클릭하면 플레이트를 즉시 읽을 수 있습니다.
405 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 판독하고, 모든 미지의 샘플에서 분석 배지 흡광도의 자동 뺄셈을 수행합니다. 흡광도 값이 각각 0.93 및 0.9를 초과하지 않았을 때 MPO-DNA 및 NE-DNA 모두에 대해 신뢰할 수 있는 표준 검량선이 얻어졌다. 가장 높은 OD는 DNase I의 밀리리터 당 0.6 마이크로 그램이 적용되었을 때 얻어졌다.
건강한 대조군의 복합체에 대한 분석 간 변동 계수는 각각 1.871 및 0.987이었고, COVID-19 환자는 각각 2.532 및 2.010의 변동 계수를 보였다. MPO-DNA 및 NE-DNA에 대한 평균 분석간 가변성 계수는 각각 6.524 및 4.389였다. MPO-DNA 및 NE-DNA 복합체에 대한 포획 항체의 특이성은 이소형 대조군 항체가 복합체에 거의 반응하지 않는다는 것을 보여주었습니다.
두 복합체의 비율은 건강한 대조군에 비해 COVID-19 환자의 혈장에서 더 높았습니다. DNase 소화 시간을 최적화해야 하며, 그렇지 않으면 과도한 소화는 흡광도를 감소시킵니다.
