식도 편평 세포 암종(ESCC)은 치명적이며 전 세계적으로 널리 퍼져 있습니다. 3차원 오가노이드는 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 현장의 진행을 가속화하는 데 활용될 수 있습니다. 4NQO로 처리된 마우스의 단일 세포 유래 3D 오가노이드는 ESCC 개시 및 개발에 수반되는 분자 변화의 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있습니다.
이 모델은 돌연변이원 유발 종양의 유전적 이질성을 포착합니다. 따라서 이러한 오가노이드는 새로운 치료 전략을 테스트하거나 종양 형성을 유발하는 두드러진 유전적 변화를 식별하기 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다. 동물 해부 및 장기 수집을 시연하는 데 도움을 주는 것은 직원 동료인 Yasuto Tomita가 될 것이며, 파라핀 포매 절차를 위한 오가노이드 준비를 시연하는 것은 제 실험실의 박사후 연구원인 Norihiro Matsuura가 될 것입니다.
시작하려면 복부 중간 털을 꼬집고 수술 용 가위를 사용하여 안락사 된 생쥐의 피부를 열고 하복부에서 턱까지 두개골, 복부 정중선을 절개합니다. 정중선 절개에서 시작하여 마우스 양쪽의 팔다리까지 방사형 절단을하고 피부 플랩을 팽창시킵니다. 자궁 경부 기관을 노출시키기 위해 해부 가위를 사용하여 정중선에서 타액선을 나눕니다.
흉부 기관을 노출시키려면 흉골을 제거하십시오. 집게로 복막을 부드럽게 꼬집고 들어 올리고 가위를 사용하여 복막을 두개골로 나눕니다. 그리고 흉곽을 따라 측면으로.
횡격막의 꼬리 표면에서 간을 부드럽게 수축시키고 가위를 사용하여 흉골 노치, 특히 xiphoid process의 등쪽 표면에서 횡격막에 작은 절개를합니다. 흉곽이 흉부 내용물에서 분리되면 횡격막의 절개 부위에 가위를 삽입하고 흉골의 등쪽 표면에 밀착 된 자궁 경부 거들을 두개골로 해부하여 아래 장기의 손상을 방지합니다. 가위를 사용하여 흉골 양쪽의 갈비뼈를 자르고 흉골을 제거합니다.
복부 식도를 노출시키려면 집게로 앞쪽을 잡고 위를 부드럽게 들어 올립니다. 가위를 사용하여 위와 식도에서 비장, 췌장 및 장간막을 해부합니다. 흉부 식도를 노출시키려면 즉시 갑상선 연골에 꼬리가 있는 기관을 부드럽게 들어 올리고 홍채 가위를 사용하여 기관 등쪽의 식도를 해부합니다.
홍채 가위로 갑상선 연골의 기관을 나눕니다. 식도의 나머지 부분을 꼬리 방향으로 조심스럽게 해부하여 기관을 떼어냅니다. 기관과 함께 폐, 심장 및 흉선을 모두 제거하십시오.
가위로 유문에서 위를 나눕니다. 집게로 antrum을 잡고 두개골로 해부하여 식도를 척추에서 분리하십시오. 갑상선 연골 수준에서 식도를 나누고 식도와 위를 모두 수확하십시오.
심장에서 식도를 나누어 위와 식도를 분리하고 식도 외부 표면의 근막을 해부합니다. 조직학을 위해 샘플을 예약하려면 가위로 세로로 나눕니다. 남아있는 온전한 식도와 차가운 PBS를 얼음 위에 놓습니다.
더 큰 곡률을 따라 위를 열고 PBS로 충분히 씻으십시오. 앞위를 분리하고 차가운 PBS로 씻으십시오. 혀를 수확하려면 코에서 고정 바늘을 제거하고 핀셋으로 혀를 빼냅니다.
혀를 가능한 한 길게 자르고 얼음 위의 차가운 PBS에 넣으십시오. 해리 된 조직을 배양 접시에 옮긴 후 집게를 사용하여 상피에서 근육층을 조심스럽게 제거하십시오. 상피를 0.25% 트립신 500마이크로리터가 들어 있는 미세 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 37도 및 800rpm에서 10분 동안 열혼합기에서 배양합니다.
간단한 원심 분리 후, 원형 운동을 사용하여 넓은 구멍 팁이있는 50 밀리리터 원추형 튜브에 보관 된 100 마이크로 미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 옮긴 다음 3 밀리리터의 대두 트립신 억제제 또는 STI를 원을 그리며 스트레이너를 통해 세척 한 다음 1 밀리리터 투베르쿨린 주사기 플런저의 바닥으로 스트레이너를 문질러 세포를 밀어 넣습니다. 3 밀리리터의 PBS로 여과기를 3-5 회 세척하고, 세척 사이에 주사기 바닥으로 여과기를 문지릅니다. 원심분리에 의해 세포를 펠릿화한 후, 상층액을 제거하고 재현탁을 위해 튜브에 1밀리리터의 용액을 남깁니다.
펠릿이 다시 현탁되면 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 다시 원심분리한 후 펠릿을 100마이크로리터의 마우스 오가노이드 배지(MOM)에 재현탁하고 자동 세포 계수를 수행합니다. 플레이트 5, 75 % 기저 막 추출물 또는 BME의 000 개의 생존 세포 및 웰 당 50 마이크로 리터의 총 부피를 갖는 MOM.
200마이크로리터 광경 팁을 사용하여 팁과 웰의 바닥 또는 측면 사이의 접촉을 피하면서 각 웰의 중앙에 50마이크로리터 물방울을 천천히 추가합니다. BME가 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5% 이산화탄소 및 95% 상대 습도로 30분 동안 응고되도록 합니다. 배양 후 웰 당 500 마이크로 리터의 MOM을 조심스럽게 첨가하십시오.
3 일 또는 4 일에 엄마를 바꾸고, 그 후 2-3 일마다 통과 할 준비가 될 때까지 교체하십시오. 해동된 BME를 얼음 위에 보관하고 MOM, 0.05% 트립신 및 STI를 섭씨 37도까지 예열한 후 사용하십시오. 광구경 마이크로피펫 팁을 사용하여 상층액과 함께 BME 돔의 오가노이드를 수집하고 위아래로 피펫팅하여 BME를 방해합니다.
간단한 원심분리로 오가노이드 펠릿을 얻은 후 제거되면 0.05% 트립신 500마이크로리터에 재현탁합니다. 섭씨 37도 및 800rpm의 열 혼합기에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 600 마이크로 리터의 STI로 트립신을 비활성화하십시오.
원심분리하고 상층액을 버린 후, 세포 펠릿을 100 마이크로리터의 MOM에 재현탁시킨다. 트리판 블루 배제를 통해 자동 세포 계수를 수행합니다. 오가노이드를 고정하려면 펠릿을 부드럽게 제거하고 섭씨 4도에서 밤새 4%파라포름알데히드 300마이크로리터에 재현탁합니다.
다음으로, 미세 원심분리기 튜브 랙을 뒤집고 표면을 천장 필름 시트로 덮어 매립 표면을 준비한 다음 해당 오가노이드 ID로 레이블을 지정합니다. PBS로 세척한 오가노이드 펠릿에서 제거된 파라포름알데히드를 튜브 측면에 50마이크로리터의 한천을 추가하여 조심스럽게 오버레이합니다. 이 단계를 반복합니다.
펠릿을 방해하지 않고 한천 겔 방울의 펠릿을 매립 표면의 천장 필름으로 옮겨 섭씨 4도에서 45 분 동안 응고시킵니다. 집게를 사용하여 응고된 오가노이드 펠릿이 들어 있는 액적을 라벨이 붙은 병리학 카세트에 조심스럽게 옮깁니다. 정상 쥐 식도 혀 및 전위 오가노이드를 명시야 이미징 및 조직학적 염색에 의해 형태학적으로 분석하였다.
4NQO 처리된 마우스의 식도 편평 세포 암종은 핵 이형성과 갑작스러운 각질화를 나타냈습니다. 계대 배양 시 오가노이드 형성 속도를 결정하여 평가한 오가노이드의 자가 재생 능력은 성숙한 오가노이드에서 감소된 증식성 기저 세포를 반영하여 형성 속도가 시간의 함수로 감소하는 것으로 나타났습니다. 오가노이드의 성장 동역학은 다양한 시점에서 형태에 의해 드러납니다.
오가노이드 내핵의 각질화는 10일째에 두드러집니다. 증식성 기저세포는 14일째 및 21일째 시점에서도 가장 바깥쪽 세포층에 남아 있습니다. 4NQO를 처리하지 않은 마우스에서 생성된 정상 마우스 혀 오가노이드의 개체군 배가 곡선은 여러 계대 및 장기 배양에 걸쳐 꾸준한 성장을 보여줍니다.
오가노이드는 새로운 치료 표적을 식별하기 위한 고처리량 스크리닝, 특정 유전자 기능을 조사하기 위한 CRISPR 기반 편집 또는 종양 미세 환경에서 어떤 상호 작용이 형질전환에 영향을 미치는지 정의하기 위한 공동 배양을 위한 플랫폼입니다. 이 기술을 통해 우리는 공기 소화관 편평 세포 암의 생물학에서 면역 체계와의 상호 작용과 함께 부분 EMT 및 HPV 감염과 같은 현상을 조사할 수 있었습니다.
