우리의 배양 시스템은 종양-기질 상호 작용에 응하여 폐 편평상피 세포 암 세포의 현상부 가소성 및 폐 편평상피세포 암 진행 도중 종양 형태를 어떻게 조절하는지 포착합니다. 우리 시스템의 주요 장점은 악성 세포의 가소성을 유지하면서 3D 컨텍스트에서 폐 편평세포 생물학을 모델링하는 능력입니다. 이 3D 공동 문화는 종양-스트로마 세포 상호 작용을 조사하는 독특한 시스템을 제공하고 약물 치료에 폐 편평상피 세포 암 세포 및 암 관련 섬유아세포의 반응을 모니터링하도록 적응될 수 있었다.
우선, 하룻밤 사이에 섭씨 4도 냉장고에 지하 막 매트릭스의 유리병을 해동합니다. 하룻밤 사이에 영하 20도의 2밀리리터 플라스틱 파이펫과 팁을 식힙니다. 다음 날, TUM622 세포, HEPES 버퍼, 트립신/EDTA 및 트립신 중화 버퍼를 섭씨 37도의 수조에서 해리화하는 데 사용되는 시약을 따뜻하게 합니다.
해동된 지하 멤브레인 매트릭스를 냉장고에서 꺼내 얼음 위에 바이알을 놓습니다. 얼음 위에 놓인 금속 플랫폼 쿨러에서 조직 배양 판을 식힙니다. 원심분리기 튜브를 금속 냉각 랙에 얼음 위에 놓습니다.
준비될 각 우물의 우물 수와 세포의 농도에 따라 필요한 세포의 양을 계산합니다. TUM622 셀 서스펜션을 냉각된 원심분리기 튜브로 옮기고 5분간 섭씨 4도에 있는 양동이 원심분리기에서 300배 g로 회전합니다. 지망파이펫을 여과되지 않은 팁에 부착하여 주퍼를 조심스럽게 흡인하여 약 200 마이크로리터를 튜브에 남깁니다.
튜브 의 측면을 부드럽게 탭하여 펠릿을 빼내고 분리한 다음 냉각 랙으로 되돌십시오. 2밀리리터 미리 냉각된 파이펫을 사용하여 매트릭스를 얼음 위에 부드럽게 섞어 몇 번 위아래로 피펫을 섞습니다. 이 절차 중에 거품이 매트릭스에 도입되지 않도록 균일하고 적당한 속도로 파이펫을 입력합니다.
각 원심분리기 튜브에 매트릭스의 1.1 밀리리터를 옮김합니다. 미리 냉각된 팁을 사용하여 각 튜브의 매트릭스를 약 10회 위아래로 피펫하여 균일한 셀 서스펜션을 만듭니다. 셀 매트릭스 서스펜션의 310 마이크로리터를 미리 냉각된 24웰 플레이트의 각 웰으로 옮기.
파이펫을 플레이트 표면에 90도 각도로 놓고 서스펜션을 우물 중앙에 추가합니다. 서스펜션은 전체 의 우물을 퍼뜨리고 덮습니다. 다운스트림 면역 형광 분석을 용이하게하기 위해, 세포 매트릭스 현탁액의 60 마이크로 리터를 2 웰 챔버 슬라이드의 우물 중심으로 옮기.
이를 통해 매트릭스는 훨씬 작은 볼륨을 가진 돔 형 구조를 형성할 수 있습니다. 플레이트와 챔버 슬라이드를 조직 배양 인큐베이터로 되돌리고 30분 동안 배양하여 매트릭스가 응고할 수 있도록 한다. 그 후, 플레이트를 검사하고 단일 세포가 매트릭스 내에서 균등하게 분포되도록 가벼운 현미경 으로 밀어.
미리 데워진 3D 배양의 밀리리터 를 플레이트의 각 웰에 넣고 챔버 슬라이드의 각 웰에 3D 배양 배지의 1.5 밀리리터를 넣은 다음 인큐베이터로 돌려놓습니다. 앞에서 설명한 바와 같이 TUM622 및 CAFs의 세포 현탁액을 준비한 후, 10마이크로리터의 셀 서스펜션을 트라이팬 블루의 10 마이크로리터와 혼합하여 CAF 세포 밀도를 계산한다. 혈종계의 두 챔버 각각에 혼합물 10 마이크로리터를 추가하여 세포 밀도를 계산하고 계산합니다.
지하 멤브레인 매트릭스에 TUM622 세포 및 CAF를 공동 으로 포함시키기 위해 먼저 세포 밀도 정보에 기초하여 도금에 사용되는 원하는 수의 세포를 계산합니다. CAF는 TUM622 세포의 2:1 비율로 시드됩니다. 동일한 원심분리기 튜브로 TUM622s의 계산된 부피와 CAF 셀 서스펜션을 전송합니다.
스핀 다운하고 모든 매체를 흡인. 지하 멤브레인 매트릭스및 플레이트 310 마이크로리터의 혼합물을 24웰 플레이트의 각 웰에 재연한다. 면역 형광을 위해, 이전에 설명된 바와 같이 TUM622 및 CAF 혼합물의 60 마이크로리터를 챔버 슬라이드로 이송한다.
지하 멤브레인 매트릭스에 오버레이 CAF와 함께 TUM622를 공동 문화하기 위해, 먼저 이전에 설명한 대로 TUM622 단문화를 설정하고, CAF 서스펜션의 수를 원심분리기 튜브로 두 배 옮기고, 실온에서 5분 동안 300배 g로 회전한다. 초대형 체적을 흡인하고 배양 배지에서 CAF를 재중단하고, 배양 배지에서 재중단된 CAF 세포의 수를 각 우물로 이송하여 임베디드 TUM622 세포를 포함하는 각 우물로 이송한다. 2D 배양에 있는 전형적인 TUM622 세포는 CAFs가 평평하고 길어지는 동안 큰 핵으로 반올림됩니다.
3D 배양에서 시드된 단일 TUM622 세포는 내장되었을 때 아시나같은 형태를 가진 오르가노이드를 형성할 수 있었습니다. 5일과 7일 사이에, 루멘은 아시나같은 구조물에서 명백해졌고 그 후 비어 있었다. 중공 루멘을 둘러싼 세포의 단층으로 구성된 각 아시누스는 생체 내의 폐 상피와 유사한 적절한 정압적 기저 극성을 표시했다.
이러한 아시나리 같은 구조는 초플라스틱이었고 세포 외 매트릭스가 완전히 붕괴되기 24 일까지 계속 성장했습니다. TUM622-CAF 공동 문화에서 오버레이 또는 공동 포함, CAFs의 존재는 크게 형성 된 스페로이드의 수와 크기를 향상. 흥미롭게도, TUM622 acini가 CAF와 근접하게 되었을 때, 그들은 아시니를 침략적이고 CAF로 이동하도록 유도하여 눈물 방울과 같은 구조를 형성했습니다.
아시나리구조의 견고한 형성을 보장하기 위해서는 세포를 내장하는 전체 과정에서 지하 막 매트릭스를 액체 형태로 유지하는 것이 중요합니다. TUM622 organoids는 면역형광, 면역 조직화학, 유동 세포측정, RNA 및 단백질 추출을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 다운스트림 분석에 사용될 수 있으며 약물 스크리닝을 위해서도 변형될 수 있다. 이 시스템을 플랫폼으로 사용하면 종양 세포 내재뿐만 아니라 종양 미세 환경의 세포 외신 변화가 종양 상피 아키텍처 및 암종 형성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 조사할 수 있습니다.
