이러한 방법은 3D 설정에서 면역 세포 매개 종양 세포 세포 독성 및 침략적 행동에 기계적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 3D 스페로이드 공동 배양 모델이 여러 후속 에세이에 대한 스페로이드의 전송을 필요로하지 않는다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 부서의 박사 과정 학생 인 Apsra Nasir입니다.
세포 배양 후드에서 무균 기술을 사용하여 스페로이드를 생성하기 위해 500 마이크로리터의 용융 아가로즈를 81 마이크로웰 고무 몰드에 첨가하여 거품을 피한다. 아가로즈가 고화되면 고무 몰드를 조심스럽게 구부려 아가로즈를 12웰 플레이트의 개별 우물로 던져 넣습니다. 캐스트를 평형화하기 위해 각 우물에 10 %의 태아 소 혈청으로 보충 된 세포 배양 배지의 2.5 밀리리터를 추가하고 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
인큐베이션의 끝에서 먼저 주변의 세포 배양 배지를 제거하기 위해 플레이트를 기울인 다음, 종착실에서 각 세포 종자 챔버로 종양 세포 현탁액에 대한 준비된 190 마이크로리터를 신중하게 종자한다. 세포 배양에서 15분 동안 인큐베이션을 한 후 배지의 2.5 밀리리터에서 주조의 외부로 첨가하고 플레이트를 48시간 동안 인큐베이터로 반납한다. T세포 공동배양을 설정하여 190마이크로리터에서 부적절한 T세포 배양의 적절한 수의 T세포를 재중단하고, 12개의 웰 플레이트당 배지가 먼저 주조된 세포 배양 배지의 제거를 허용한다.
그런 다음 파종 실에서, 스페로이드를 제거하지 않고, 어떤 구체가 흡인되었는지 여부를 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용하고 각 캐스트 위의 P200로드 파이펫을 조심스럽게 스퍼로이드를 해체하지 않고 드롭 와이즈 방식으로 캐스트에 T 세포를 시드. 모든 캐스트가 신중하게 시드되면 15 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반납한 후 태아 소 혈청으로 보충된 신선한 세포 배양 배지를 추가하여 48시간 의 배양에 대한 추가로 배양한다. 3D 공동 배양을 1형 콜라겐 희석 주식 콜라겐과 혈청 프리 베이스 배지로 원료 콜라겐을 밀리리터당 3밀리그램의 최종 작동 농도로 포함하고 10X PBS의 11마이크로리터를 추가하려면 콜라겐 100마이크로리터당 1개의 어금니 암나트륨 수산화수소 1.2 마이크로리터를 첨가한다.
얼음에 콜라겐 용액을 1시간 동안 중화한 후, 각 주조 내 및 각 주전 내의 세포 배양 매체를 제거한다. 중화 콜라겐 1개의 혼합물을 드롭와이즈 방식으로 각 캐스트에 신중하게 추가하고, 즉시 배양에서 1시간 동안 플레이트를 반전시키기 전에 5분 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반납하였다. 인큐베이션의 끝에 플레이트 오른쪽을 생물 안전 후드에 올려 놓고 천천히 각각의 양쪽에 신선한 세포 배양 배지를 추가합니다.
그런 다음 48 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다. 임베디드 3D 공동 배양의 면역형 염색을 위해 가습 챔버에서 실온에서 하룻밤 동안 5.4%의 포르말린으로 스페로이드를 포함한 각 전체 아가로즈 캐스트를 수정한다. 다음 날, 아가로즈 캐스트를 둘러싼 포르말린을 제거하고 매끄러운 팁 핀셋을 사용하여 각 콜라겐 매트릭스의 모서리를 파악하여 캐스트가 단일 유체 운동으로 파종 챔버에서 벗겨질 수 있도록 합니다.
각 콜라겐 패치를 8개의 웰 챔버 슬라이드의 단일 웰에 넣고 각각 우물에 0.5%의 옥옥시놀 250 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 후 차단 용액의 250 마이크로 리터로 옥옥시놀을 대체합니다. 실온에서 1 시간 후 각 우물에 관심의 주요 항체 칵테일의 250 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 밤새 어두운 가습 챔버에 슬라이드를 배치합니다.
다음날 아침 각 우물에서 1차 항체를 제거하고 300 마이크로리터의 IF 버퍼로 3회 세척당 실온에서 5분간 세척합니다. 마지막 세척 후, 빛으로부터 보호실온에서 1시간 동안 각 웰에 부적절한 이차 항체 용액 250마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서 항체를 제거하고 입증된 바와 같이 IF 버퍼로 각 샘플을 세 번 세척한다.
마지막 세척 후 잘 당 PBS의 300 마이크로 리터와 샘플을 헹구고 조심스럽게 챔버 슬라이드의 벽을 제거합니다. 그래서 하단에 유리 슬라이드만 남아 있습니다. 유리 슬라이드에 장착 매체 200 마이크로리터를 추가하고 조심스럽게 거품을 만들지 않고 샘플에 커버 슬립을 떨어뜨린 다음 공초점 형광 현미경에 의해 이미징하기 전에 밤새 어두운 건조한 장소에 장착 된 샘플을 저장하고 각 프로토콜에 대한 실험의 끝에 대표및 분석 가능한 샘플을 산출 할 수 있습니다.
아가로즈 캐스트의 마이크로 웰 내에 3D 배양을 배합하면 이미지에 의한 침략을 모니터링 및 분석할 수 J.In 2개의 1차 뮤린, 췌장암 세포주상이 다른 스페로이드 모양 및 침습적 행동을 관찰했다. 첫 번째 세포주 하나는 단일 세포 침공을 관찰한 것과 유사한 보다 컴팩트한 스페로이드 형성과 뾰족한 침공을 보여 주었다. 제 2 세포주는 더 느슨하고 집단 침략 패턴을 입증 하는 스페로이드를 형성 하는 동안.
공동 배양은 종양 스페로이드 형성 또는 후속 종양 T 세포 상호 작용 평가시 종양 및 T 세포와 동시에 시드되는 두 가지 상이한 종양 클론 세포 주체로 수행될 수 있다. 침습적 행동의 상세한 평가를 위해 면역형광 염색 및 콘 초점 이미징은 높은 처리량 방식으로 수행될 수 있다. 아가로즈 캐스트는 종양과 T 세포 사이의 공간 관계를 정량화하기 위해 직렬 단면 및 면역 히스토케화학 염색을 위해 파라핀에 전체 3D 배양 시스템을 포함시킬 수 있게 한다.
예를 들어, T 세포 침투는 세포 표면 마커 염색을 식별하고 특성화할 수 있다. 이 기술은 환자 샘플의 분석뿐만 아니라 자극 및 종양 세포 T 세포 상호 작용을 탐구하는 약물을 차단의 사용을 할 수 있습니다.
