세포 배양은 통제된 실험실 환경에서 다양한 유형의 세포와 조직을 성장시키는 데 필요한 섬세한 기술입니다. 세포 배양 작업을 수행할 때 가장 먼저 고려해야 할 사항은 오염입니다. 이 오염은 박테리아, 곰팡이 또는 마이코플라스마의 형태로 나타날 수 있습니다.
이 비디오에 요약된 모든 기술과 관행은 세포가 생존 가능하고 건강하며 오염 없는 상태를 유지하도록 합니다. 이러한 관행은 엄격히 준수되어야하며 모든 실험실 직원은 적어도 일년에 한 번 교육을 받아야합니다. 작업을 시작하기 전에 세포 배양실에서만 사용하도록 지정된 깨끗한 실험실 코트를 착용하십시오.
다른 표면에 닿지 않은 새 장갑을 착용하십시오. 장갑이 단단히 끼워졌는지 확인하십시오. 니트릴 가루가 없는 장갑이 가장 좋습니다.
실험복과 장갑은 멸균 상태일 필요가 없습니다. 작업을 준비하기 위해 스프레이 장갑, 실험실 코트 슬리브 및 생물 안전 캐비닛 내부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 작업 표면, 측면, 후면, 캐비닛의 모든 품목 및 전면 유리 패널에 내부와 외부 모두에 스프레이를 뿌립니다.
보푸라기가 없는 종이 타월로 작업 표면과 유리 패널을 닦아냅니다. 캐비닛 내부에 작업 공간을 배치하는 데 시간을 할애하십시오. 세포 배양실 내부에 수조를 보관하고 매체 데우기 또는 세포 해동과 같은 세포 배양 목적으로만 사용하십시오.
수조는 일주일에 한 번 배수하고 씻어야합니다. 캐비닛으로 가져오는 품목의 양을 제한하고 전면 또는 후면 그릴을 막아 생물 안전 캐비닛 내부의 공기 흐름을 방해하지 마십시오. 캐비닛 내부에 있는 모든 품목에 70% 에탄올을 뿌리고 물기를 닦아냅니다.
미디어 병의 상단에 스프레이를 뿌리는 것으로 시작하여 아래로 내려갑니다. 깨끗한 종이 타월을 사용하여 미디어 병의 상단에서 시작하여 건조시키고 점차적으로 바닥으로 이동합니다. 캡 쪽으로 다시 올라가지 마십시오.
이 캐비닛이 작동하는 방식은 전면 및 후면 그릴을 통해 방과 캐비닛 자체에서 공기를 끌어들이는 것입니다. 공기는 캐비닛 뒤쪽과 위쪽으로 이동합니다. 그곳에서 오염된 공기는 필터 더미를 통과하고 여과된 깨끗한 공기의 일부가 캐비닛의 작업 영역으로 밀려납니다.
캐비닛이 혈청학적 피펫을 수용할 수 있을 만큼 충분히 크면 내부에 배치할 수 있고, 그렇지 않으면 캐비닛 외부에 장착된 용기에 보관할 수 있습니다. 사용하기 전에 포장에 구멍, 찢어짐 또는 구멍이 있는지 밀봉된 피펫의 양쪽 면을 확인하는 것이 좋습니다. 포장을 뜯지 마십시오.
대신 포장의 끝을 부드럽게 벗겨냅니다. 혈청학적 피펫을 피펫 보조제에 삽입하고 한 번의 유체 동작으로 포장을 제거합니다. 열린 병이나 플라스크 위로 마우스를 가져가지 마십시오.
열린 병이나 플라스크 위에 손을 뻗거나 열린 플라스크 위에서 작업하는 것은 권장하지 않습니다. 캐비닛 내부의 공기 흐름은 내부의 모든 것을 아래로 밀어냅니다. 손을 뻗으면 소매나 장갑이 품목 위에 놓일 수 있으며, 이는 예를 들어 소매에 존재하는 오염을 세포 배양으로 밀어 넣을 수 있습니다.
가능하면 액체를 붓지 마십시오. 대신 혈청 학적 피펫을 사용하여 추가하십시오. 내용물을 완전히 섞고 병에 이니셜을 넣습니다.
미디어가 보완되는 내용을 기록하십시오. 접착 배양 물로 작업 중이고 플라스틱 플라스크가 필요한 경우 전체 패키지를 스프레이하고 내부에 넣으십시오. 장갑이 마를 때마다 에탄올을 다시 뿌립니다.
부착성 세포주로 작업할 때 오토클레이브 유리 피펫 또는 일회용 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 배지 또는 세척 용액을 흡인합니다. 보관 용기에서 금속 캡을 조심스럽게 제거합니다. 용기를 비스듬히 부드럽게 흔들어 하나의 유리 피펫을 분리합니다.
용기에 손을 뻗을 때 다른 피펫을 만지지 마십시오. 선택한 피펫을 한쪽 끝에서만 다루십시오. 가능한 한 빨리 병과 플라스크의 캡을 신속하게 교체하십시오.
림이 작업 표면에 닿지 않도록 작업 표면에 캡을 거꾸로 놓습니다. 상단이나 하단에서 캡을 잡지 마십시오. 대신 측면에서 캡을 만지십시오.
액체를 흡입할 때는 캐비닛 외부에 있는 진공 트랩 플라스크를 바닥의 보조 용기에 사용하십시오. 캐비닛 내부에서 작업하는 동안 폐기물이 생성됩니다. 캐비닛 안팎으로 손을 너무 자주 움직이면 공기 흐름이 방해를 받기 때문에 캐비닛 내부에 쓰레기를 임시로 남겨두는 것이 좋습니다.
작업에 방해가 되지 않도록 옆으로 치워둡니다. 장갑이 건조해질 때마다 70% 에탄올을 넉넉히 뿌립니다. 물이 뚝뚝 떨어지지 않도록 손을 문지릅니다.
혈청학적 피펫에 대한 간략한 참고 사항. 실수로 후드의 다른 것을 만지면 주저하지 말고 버리십시오. 오염될 수 있는 피펫을 사용하는 대신 깨끗한 혈청학적 피펫으로 신선하게 시작하는 것이 가장 좋습니다.
인큐베이터에 세포를 넣기 전에 현미경으로 어떻게 보이는지 확인하십시오. 단세포를 관찰해야 합니다. 이것은 세포가 완전히 재현탁되었음을 나타냅니다.
인큐베이터에 말하거나, 재채기하거나, 기침하거나, 심하게 숨을 들이쉬지 마십시오. 인큐베이터 도어를 빠르게 열고 닫습니다. 필요 이상으로 오래 열어 두면 공기 중에 존재하는 오염 물질이 인큐베이터로 들어갈 수 있습니다.
캐비닛에서 꺼내기 전에 모든 병의 캡이 완전히 닫혀 있는지 확인하십시오. 미디어는 빛에 민감합니다. 사용하지 않을 때는 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관해야 합니다.
세포 배양 작업이 완료된 후 캐비닛 내부에 다시 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 표면을 닦아 건조시킵니다. 생물학적 위험 폐기물 봉투를 비우십시오. 이 과정을 반복하고 다른 세포주로 전환할 때 장갑을 교체하십시오.
유리 플라스크에서 자란 현탁액 배양으로 작업할 때는 장갑이 젖었는지 확인하십시오. 젖은 장갑으로 알루미늄 호일을 만진 다음 플라스크 바닥에만 스프레이를 뿌린 후 생물학적 안전 캐비닛 안에 넣습니다. 세포 계수를 위해 샘플을 채취할 때 용기에서 1.5ml 튜브 하나만 제거하십시오.
다른 튜브를 만지지 마십시오. 작업 표면에 캡을 거꾸로 놓습니다. 안쪽 테두리를 만지지 마십시오.
측면에서 조심스럽게 다루고 완료되면 교체하십시오. 현탁액 셀과 유리 플라스크를 취급할 때 플라스크의 목 전체를 덮고 있는 이중 접힌 알루미늄 호일 조각을 조심스럽게 제거합니다. 네 모서리를 모두 부드럽게 당기고 작업 표면에 호일을 거꾸로 놓습니다.
유리 플라스크는 바닥에서만 다루십시오. 호일이 벗겨진 후에는 목에서 만지지 마십시오. 1ml 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 계수를 위한 샘플을 채취합니다.
미디어가 플라스크 측면으로 떨어지지 않도록 하십시오. 그렇다면 종이 타월에 70% 에탄올을 뿌리고 즉시 청소하십시오. 생물학적 안전 캐비닛에서 병이나 플라스크를 제거하기 전에 캡이나 알루미늄 호일이 조여졌는지 확인하십시오.
다른 세포 유형에 대해 별도의 인큐베이터를 사용하십시오. 이렇게 하면 서로 다른 세포 유형의 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 캐비닛 외부의 액체 폐기물을 수집하기 위한 진공 트랩 플라스크를 바닥에 폐기물이라고 표시된 보조 용기에 넣는 것이 좋습니다.
호스는 매월 교체되는 필터에 연결됩니다. 호스는 캐비닛 측면을 통해 들어갑니다. 작업이 완료되면 생물학적 위험 쓰레기를 제거하십시오.
싱크대 옆 벽에 유리 세척 프로토콜을 유지하십시오. 먼저 버려진 세포를 10% 표백제로 약 5분 동안 담급니다. 그런 다음 표백제 혼합물을 버리고 플라스크를 물로 완전히 헹굽니다.
물로 비누를 넣고 브러시로 잘 문지르고 더 많은 물로 헹굽니다. 그리고 마지막 단계는 오른쪽 수도꼭지의 DI 물로 유리 제품을 헹구는 것입니다. 유리 플라스크를 가능한 한 빨리 씻고 유리 제품을 잘 문지릅니다.
Sf9 세포는 제대로 문지르지 않으면 죽은 세포의 테두리를 남깁니다. 이 플라스크는 유리 세척 시설로 보내는 대신 세포 배양, 오토클레이브 세포 배양 유리 제품에만 사용하십시오. 오토클레이브의 진공 사이클을 멸균 시간 40분과 건조 시간 40분 동안 사용하십시오.
실험실의 주요 영역에 있는 유리 제품과 분리하여 보관하십시오. 모든 공급품이 한 영역에 위치하도록 세포 배양실을 구성하여 실험실 구성원이 공급품을 찾기 위해 세포 배양실을 나갈 필요성을 최소화합니다. 세포를 수확하는 데 사용되는 플라스틱 병에 라벨을 붙이고 나중에 세포 배양에 재사용하는 경우 세포 배양 전용입니다.
하나의 특정 세포 유형에 대해 지정된 세포 배양 병을 사용하십시오. 이 병은 쉽게 접근할 수 있도록 세포 배양실에 보관하십시오. 현탁액에서 자란 배양 물의 경우, 곰팡이는 배지에서 떠 다니는 공으로 인식됩니다.
박테리아 오염에 관해서는 매체가 하얗고 흐려집니다. 유사하게, 부착 세포의 경우, 곰팡이 오염은 퍼지 패치로 쉽게 인식 될 수 있습니다. 박테리아 오염은 일반적으로 맑은 매체로 변하고 흰색과 흐림으로 변합니다.
많은 종류의 마이코플라스마는 PCR 기반 분석을 사용하여 확실하게 식별할 수 있습니다. 왼쪽의 밴드는 DNA의 분자량 표준을 나타냅니다. 오른쪽에 있는 4개의 밴드는 양성 대조군입니다.
마이코플라스마가 검출되지 않았기 때문에 테스트된 세포 유형에서 밴드가 나타나지 않습니다. 세포 배양 배지는 pH 지표가 있는 경우 빨간색에서 노란색으로 색상이 바뀝니다. 노란색은 pH가 낮고 매체를 교체해야 함을 나타냅니다.
세포 수를 수행하는 동안 광학 현미경으로 다른 성장 또는 세포 모양이 관찰되면 이는 오염의 지표가 될 수 있습니다. 이러한 유형의 파편은 세포 배양 자체가 아닌 혈구계에만 존재할 수 있으므로 세포 계수 전에 혈구계의 철저한 세척을 수행해야 합니다. 오염은 세포 배양 작업을 수행할 때 주요 관심사 중 하나이지만 이 비디오에 설명된 관행과 기술을 따르면 이러한 위험을 완화할 수 있습니다.
매월 마이코플라스마 검사를 실시하고, 검사실 직원에게 매년 교육을 실시하며, 이러한 관행을 엄격히 준수하면 세포가 건강하고 오염되지 않은 상태를 유지할 수 있습니다. 이는 또한 값비싼 세포 배양 배지 구매, 새로운 세포 구매와 관련된 비용을 줄이는 데 도움이 되며 인큐베이터 오염 제거 가동 중지 시간을 줄일 수 있습니다. 성공적인 세포 배양의 핵심은 애초에 오염을 방지하기 위한 조기 조치라는 것을 기억하십시오.
