자사는 3D 바이오리액터를 사용하여 활액 중간엽 줄기세포로부터 다수의 GMP 등급 엑소좀을 생산하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 엑소좀은 엑소좀 생물학 연구 및 임상 관절염 치료에 활용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 Yujie Liang 박사가 될 것입니다.
활액을 섭씨 4도에서 10 분 동안 1, 500 배 G로 원심 분리하여 인간 중간 엽 세포 또는 MSC를 수집하기 시작하십시오. 원심분리 후, 상청액을 버리고 10 밀리리터의 PBS로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 재현탁된 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 500배 G로 원심분리하고, PBS를 버리기 전에 펠렛을 5배 10 밀리리터의 세포 밀도로 인간 MSC 배양 배지로 재현탁시킨 다음 현탁액을 100 밀리미터 접시에 플레이트화한다.
접시를 섭씨 37도의 5%이산화탄소가 포함된 분위기에서 배양합니다. 2주 후, 세포 배양 상청액을 수집하여 유세포분석을 사용하여 활액 중간엽 줄기 세포 또는 SF-MSC를 식별합니다. 그렇게 하기 위해, SF-MSCs의 3세대 계대 3을 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 000배 G에서 원심분리하여 소화시킨다.
그런 다음 세포 펠렛을 수집하기 전에 상청액을 폐기하십시오. 다음으로, 4번째에 10배 5배의 농도로 세포 펠렛에 블로킹 완충액 400 마이크로리터를 첨가하고 상기 펠렛을 실온에서 15분간 방치한다. 15분 후, 앞서 설명한 바와 같이 세포 현탁액을 원심분리한 다음, 분리된 펠렛을 100 마이크로리터의 1X PBS에 재현탁시킨다.
원고에 기재된 바와 같이 튜브당 1:100의 희석 비율로 1마이크로리터의 모노클로날 형광 항체를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션을 위해 튜브를 놓는다. 배양 후, 세포를 1X PBS로 2회 세척하고, 세포를 100 마이크로리터의 1X PBS에 재현탁시킨다. 그런 다음 적색 및 FITC 채널을 사용하여 유세포 분석기에서 최대 10, 000 개의 세포에서 형광단을 검출합니다.
마이크로캐리어를 제조하기 위해, 실온에서 적어도 3시간 동안 그램당 50밀리그램의 농도로 1X DPBS에서 0.75그램의 마이크로캐리어를 팽창시키고 수화시킨다. 이어서, 상청액을 따라 5 분 동안 신선한 DPBS에서 마이크로 캐리어를 세척한다. 배지를 그램당 마이크로캐리어 50mg의 새로운 1X DPBS로 교체한 후, 제곱인치당 15파운드로 섭씨 121도에서 15분 동안 오토클레이빙하여 마이크로캐리어를 멸균합니다.
그런 다음 상청액을 디캔팅하기 전에 멸균된 마이크로캐리어가 침전되도록 합니다. 마이크로캐리어를 실온에서 그램당 50 밀리그램의 농도로 배양 배지에서 헹구십시오. 마이크로캐리어가 침전되면, 상청액을 폐기한다.
관류 바이오리액터를 제조하려면, 앞서 기술한 바와 같이 오토클레이빙에 의해 바이오리액터를 멸균한다. 완료되면 SF-MSC의 수를 계산하여 7번째 SF-MSC에 10을 2.5배 곱하고 마이크로캐리어를 GMP 등급 MSC 배양액 250밀리리터로 관류된 바이오리액터에 할당합니다. 바이오리액터를 분당 15회전의 속도로 섭씨 37도에서 5%이산화탄소가 있는 인큐베이터에 넣습니다.
6일마다 배양 배지를 교체하십시오. 14일 후, 추가 분석을 위해 세포 배양 상청액 및 마이크로캐리어를 수집한다. 세포 배양 상층액을 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 G로 원심분리하고 세포 파편을 버리면서 상층액을 수집한다.
섭씨 4도에서 상층액을 2, 000 배 G에서 10 분 동안 순차적으로 원심 분리 한 다음 10, 000 배 G에서 30 분 동안 원심 분리하여 더 큰 소포를 버리고 펠렛을 수집합니다. 펠렛을 40 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨 후, 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 70분 동안 120, 000배 G로 원심분리한다. 이어서, 엑소좀을 함유하는 수집된 펠렛을 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다.
새로 분리된 엑소좀 샘플을 멸균 PBS로 밀리리터당 10 내지 7 내지 10 내지 9번째 입자의 농도로 희석하고, 분당 30 마이크로리터 및 섭씨 24.4 내지 24.5도에서 나노입자 추적 분석 또는 NTA 시스템에 각각 실행할 500 마이크로리터의 샘플을 주입한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 캡처 및 분석 시스템을 수동으로 설정합니다. 레이저 광 산란으로 입자를 시각화하고 디지털 비디오에서 브라운 운동을 캡처합니다.
다음으로, 소프트웨어를 사용하여 녹화된 비디오 테이프를 분석하여 실행당 최소 200개의 개별 입자를 추적합니다. 웨스턴 블로팅의 경우, 300마이크로리터의 용해 완충액과 프로테아제 억제제 칵테일을 위아래로 피펫팅하여 혼합하면서 엑소좀에 첨가합니다. 그런 다음 얼음 위에 20분 동안 그대로 두십시오.
상기 혼합물을 섭씨 4도에서 10분 동안 9, 391번 G에서 원심분리한 후, 단백질 분석 키트를 이용하여 상층액 중의 단백질 농도를 측정하였다. 분석 후, 섭씨 100도에서 100 분 동안 100 마이크로 리터의 4X 단백질 로딩 버퍼로 샘플을 가열합니다. 다음으로, 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 15마이크로리터의 단백질을 로드하여 120볼트에서 70분 동안 겔 전기영동을 실행하고 섭씨 4도에서 60분 동안 100볼트로 전기 블로팅합니다.
비-엑소좀 특이적 마커, 예컨대 칼넥신 및 엑소솜 바이오마커, 예컨대 CD9, CD63, 및 CD81을 형광 웨스턴 블롯팅에 의해 검출한다. 이 연구에서 유세포 분석은 SF-MSC의 표면 마커를 식별하는 데 사용되었습니다. 유세포 분석 결과 배양 된 SF-MSC는 CD34, CD45 및 HLA-DR에 대해 음성이고 CD73, CD90 및 CD105에 대해 양성으로 MSC의 식별 기준을 충족했습니다.
도립 현미경 검사에서 SF-MSC가 마이크로 캐리어에서 증식하는 것으로 나타났습니다. SF-MSC는 2D 배양에 비해 6일 이후 3D 배양에서 더 빠르게 증식했습니다. 2D 및 3D 배양의 SF-MSC에서 추출한 엑소좀은 웨스턴 블로팅을 이용하여 동정하였으며, 엑소좀은 칼넥신에 대해서는 음성인 반면 CD63, CD9, CD81을 발현하는 것으로 나타났다.
나노 세포 분석은 2D 및 3D 엑소 좀의 직경이 약 120 나노 미터임을 입증했습니다. 투과 전자 현미경 분석 결과 2D 및 3D 엑소좀의 형태가 밝혀져 대략 구상 소포를 보여줍니다. NTA 분석을 사용하여, 30 내지 160 나노미터 크기의 입자의 농도를 분석하였다.
3D 배양 후, 입자 농도는 밀리리터당 4.0배 10 내지 6이었다. 그러나, 2D 배양 후, 동일 크기의 입자의 농도는 밀리리터당 2.5배 내지 10배였다. 또한 3D 배양은 2D 배양보다 더 많은 엑소좀 단백질을 생성했습니다.
대표적인 분석은 1차 연골세포에 의한 딜-표지된 엑소좀의 내재화를 보여준다. 1차 연골세포에 들어간 딜 표지된 엑소좀은 3시간에 피크를 보이는 것을 볼 수 있다. 시험관 내 전달 연구는 엑소좀이 설포-시아닌3-표지된 microRNA-140을 연골세포에 전달할 수 있음을 입증했습니다.
세포를 플레이팅하고, 생물반응기에서 반응을 시작하고, 상청액을 상청액으로 하는 것이 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계이다. 3D 배양은 일반적으로 부착 세포의 대규모 배양에 사용됩니다. 스핀 플렉스와 같은 다른 방법도 엑소좀의 대규모 생산에 사용할 수 있습니다.
당사의 방법은 엑소좀의 수율을 향상시켜 MSC 엑소좀 기반 전임상 적용을 가능하게 합니다.
