이 작품은 싱가포르 NRF의 교제 (NRF-2011NRF - NRFF001-025)뿐만 아니라 CBRG (NMRC / CBRG가 / 0070 / 2014)에 의해 투자되었다.

참고 :이 연구의 맥락에서 관심의 RNA는 AR 3&#39;UTR의 단편이다. 비오틴 표지 RNA 1. 준비 <ol><li> RNA를 얻으려면, 상용 키트를 사용하여 제조 업체의 지침 (11)는 다음의 시험 관내 전사 다음 PCR에 의해 T7-AR-올리고을 증폭. 참고 : PCR 프라이머는 표 4에 나열되어 있습니다 : T7-AR-F와 T7-AR-R을. </li><li> 비특이적 결합 제어를 들어, 시험 관내 전사 하였다 psiCHECK -2- 플라스미드로부터 PCR에 의해 반딧불 루시페라아제 (FL) DNA의 부분 서열을 증폭. 참고 : PCR 프라이머는 표 4에 나열되어 있습니다 hluc (+) - T7 프로브 F 및 hluc (+) - 프로브-R 표 4 PCR 증폭을위한 템플릿과 프라이머 시퀀스... </li><li> 50 ㎕의 PCR 반응에서, 50 ng의의 DNA (올리고 또는 플라스미드)의 4 μL의 dNTPs (각 2.5 mM의 dNTP), 5 ㎕의 10 배 반응 완충액 1 ㎕를 2.5 U / &amp; # 믹스(181), 리터 DNA 중합 효소, 2 μL 10 μm의 정방향 프라이머, 2 μL 10 μm의 역방향 프라이머, 및 뉴 클레아없는 물. <ol><li> 다음 프로그램을 사용하여 열 순환기 PCR 증폭을 실행. STEP1 : 2 분, 95 ℃ 1주기; STEP2 : 30 초 동안 95 ° C의 35주기, 30 초 동안 55 ° C 및 30 초 (AR) 또는 60 초 (FL) 72 ° C; STEP3 : 10 분 동안 72 ℃에서 1주기. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침 11 다음 시험 관내 전사 키트를 사용하여 바이오틴의 RNA를 합성. 이 실험에서는, RNA 합성 템플릿으로 PCR 제품을 사용한다. 20 ㎕의 시험 관내 전사 반응에 200 ng를 PCR 증폭 된 DNA, 각 NTP 2 μL, 1 ㎕의 10 mM이 비오틴 CTP-2 배 μL 반응 완충액, 2 μL의 T7 RNA 폴리머 라제를 혼합한다. 4 시간 동안 37 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 37 &amp; #에서 시험 관내 전사, 1 μL 2 U / μL DNase의와 치료 반응 혼합물에 따라(176), C 15 분 주형 DNA를 분해합니다. 마지막으로, 이후의 정제하여 60 ㎕의 총 부피로 오티 닐화 RNA 희석. </li><li> 제조업체의 지침 12 다음 정화 열을 사용하여 염 및 비법 인 세포핵을 제거하기 위해 비오틴 RNA를 정화. 다음 풀다운 분석을 위해 -80 ° C에서 RNA 농도 및 저장을 측정합니다. </li><li> 2 분, 2 분 동안 얼음에 진정 90 ° C에서 RNA 단백질 상호 작용, 열 50 μL 비오틴 RNA (50 PM)에 대한 관심의 RNA에 대한 적절한 이차 구조를 보장하기 위해, 다음 50 μl의 2 배 RNA 구조 버퍼 (표와 공급 3), 13, 14 및 30 분 동안 실온에서 접는 RNA 허용한다. </li></ol> RNA 접합 비즈 2. 준비 참고 : 자기 구슬과 상등액의 분리 자기 스탠드를 사용합니다. <ol><li> 간단한 vorte하여 원래 바이알의 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 자성 비드를 재현 탁싱은 제조업체의 지침에 따라. 1.5 ML 튜브에 비즈를 재현 탁 150 μl를 전송합니다. 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. 참고 : RNA 풀다운 분석에서, 원래 유리 병에서 재현 탁 구슬을 분취 때, MS 다음에 분석을 위해 서부 블롯 다음에 분석을 위해 50 μl의 구슬, 200 μl의 구슬을 사용합니다. </li><li> 다시 현탁 제조자의 권장 1X W 및 B의 1 ml의 비드 펠렛 (결합 및 세척) 완충액 (표 3)에 의해 회 비드 워시 회전기에 실온에서 5 분 동안 튜브를 회전 하였다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 400 ㎕의 완충액 A의 완충액 A로 비드 펠렛을 재 - 현탁하여마다, 구슬의 RNase 불 활성화 회 비드 씻어 0.1 M NaOH를 0.05 M의 NaCl (표 3)를 함유하는 알칼리성 용액이다. 회 전자에서 실온에서 2 분 동안 튜브를 돌린다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. </li> &lt;리&gt; 회전기 실온에서 2 분 동안 튜브를 회전 뒤에 다시 현탁 400 ㎕의 완충액 B로 비드 펠렛 (표 3)에 의해 회 비드 씻어 비즈마다 NaOH를 제거한다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 300 ㎕의 2 배 W &amp; B 버퍼를 Resuspend 비드 펠렛, 분할 구슬 똑같이 세 1.5 ml의 튜브 (튜브 당 100 μl의 구슬)로 전송합니다. 100 μL의 RNase없는 물과 비드 함유 공급 튜브 100 μL는 FL의 RNA 각각 AR 3&#39;UTR RNA 바이오틴 100 μL를 비 오티 닐화. </li><li> 회전을 실온에서 1 시간 동안 각 비드 혼합물을 인큐베이션. 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 모든 상층 액을 버린다. 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 400 ㎕의 1X W 및 B 버퍼 각각 비드 펠렛을 다시 현탁 회마다 비드를 세척 회전기에 실온에서 5 분 동안 튜브를 회전 하였다. </li><li> 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 모든 상층 액을 버린다. 각 비드 PELLE를 재현 탁50 μl의 핵 분리 버퍼 (표 3)와 t. </li></ol> 3. 지방 전구 세포의 분리 및 지방 생성 유도 <ol><li> 이전 서적 5에 기재된 바와 같이, 견갑골 갈색 지방 패드로부터 전구 지방 세포 (C57BL6 야생형 마우스, 3 주)를 해부. </li><li> 성장과 체외에서 전구 지방 세포 (5) 차별화. 세포는 4~5일 분화 개시 후 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 차 지방 세포에서 세포 용 해물 4. ​​준비 주 : 파쇄 제제의 모든 절차를 확인 얼음에 만들어진 모든 버퍼 얼음에 냉각된다. 얼음 사전 냉각 다운스 유리 균질. <ol><li> 성장과 15cm 요리 (5) (3.2 절 참조) 전구 지방 세포를 분화. 각각의 요리는 하나의 RNA 풀다운 분석을위한 충분한 세포를 제공한다. 일 4 분화 폐기 세포 배양액 일 5, 세탁에서 CE한 번 1X PBS와 LLS. </li><li> RT에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 50 ML 튜브에 세포 및 펠렛 세포를 수집 긁어, 세포를 수확 세포에 10 ~ 15 ㎖의 1X PBS를 추가합니다. 1 ML의 피펫을 이용하여 상층 액을 버린다. </li><li> 재현 탁 셀이 용액에 펠릿 저장성 완충액 (표 3), 및 15 분 동안 얼음 위에서 세포를 배양한다. 전송 15 ml의 다운스 유리 균질에 세포 및 기계적으로 얼음에 20 스트로크와 전단 세포. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 3,300 XG에 원심 분리하여 펠렛은 세포 핵. 더 사용하기 위해 얼음에 핵 펠렛을 유지 (섹션 4.6 참조). 1.5 ml의 튜브에 뜨는을 전송, 4 ℃에서 15 분 동안 20,000 XG에서 최종 150 mm의 농도와 스핀을 얻을 수 뜨는하는 3M의 KCl을 추가합니다. </li><li> 원심 분리 후, 조심스럽게 1 ml를 피펫을 사용하여 상단 lipidlayeron 제거하고 세포질 세포 용 해물로 뜨는를 수집합니다. </li><li> 핵 펠렛을 재현 탁 1 ml의 핵 분리 버퍼 (4.4 절 참조). 티를 ransfer의 1 ML의 피펫을 사용하여 15 ml의 다운스 유리 균질에 핵, 기계적으로 100 스트로크와 얼음에 전단 핵. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 핵 파편 펠렛, 핵 세포 용 해물로 뜨는를 수집합니다. </li><li> 어느 쪽의 핵 및 세포질 세포 용 해물을 결합, 또는 다운 스트림 풀다운 응용 프로그램에 대해 개별적으로 각 부분을 사용합니다. 데모 실험에서, 세포 용 해물이 두 분획 1의 부피비로 혼합 하였다 1. </li><li> 0.5 U / μL의 최종 농도를 얻기 위해,이 분획을 세포 용 해물의 RNase 억제제를 추가한다. 웨스턴 블롯 (15)의 입력 컨트롤로 세포 용 해물의 옆 100 μl를 설정합니다. </li></ol> 5. 바인딩 및 RBP의 용출 <ol><li> 분할 셀 세 동일한 분취 량에 해물 (1.5 ML 튜브에 1 ㎖의 세포 용 해물), 빈과 부화는 FL RNA 접합 및 AR 3&#39;UTR RNA 접합 비즈는 4 °에서 3 시간 동안 각각 (섹션 2.8 참조) 기음회전. </li><li> 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. RNA의 완전성을 확인하기 위해 상층 액에서 RNA 분리에 이어 1 ml를 피펫을 이용하여 상층 액을 수집합니다. 제조자의 지시 (표 2) 다음 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 용액을 이용하여 RNA를 분리. 리보좀 RNA의 28S 및 18S 서브 유니트를 분석해서 RNA의 intactness 평가. 얼음에 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 회 전자에서 실온에서 2 분 동안 튜브를 회전이어서 40 U의 RNase 억제제 및 0.25 % IGEPAL를 함유 한 용액의 핵 차단 완충액으로 각 비드 펠렛을 재현 탁하여 자성 비드 여섯 번마다 세척 하였다. 자기 구슬과 상층 액의 분리를위한 자기 스탠드를 사용합니다. 모든 상층 액을 버린다. 얼음에 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 웨스턴 블로 팅을위한 비즈에서 RNA 단백질 복합체를 용출 다음 단계를 사용하십시오. 먼저, 75 μL 핵 분리 버퍼의 각 비드 펠렛을 재현 탁; 다음, 25 ㎕의 4 배 웨스턴 블롯 로딩 버피를 추가FER은 (SDS 함유) 100 μl의 총 부피를 얻었다. 마지막 5 분 동안 95 ℃에서 100 μL이 용액에 비드를 끓인다. 참고 : 사용이 단계는 MS에 대한 비즈에서 RNA 단백질 복합체를 용출 다음과 같습니다. STEP1 : 100 μL 용출 버퍼 (표 3)의 각 비드 펠렛을 재현 탁; STEP2는 : 회전 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 비드 샘플을 품어; STEP3 : 원심 분리기와 단백질 함유 상층 액을 수집; STEP4는 : MS에 제출하기 전에 20 ~ 30 μL에 단백질 솔루션을 집중한다. </li><li> 원심 분리기는 각각 100 4 ° C에서 30 초 동안 12,000 XG에 비드 샘플의 μL, 그리고 상층 액을 수집합니다. 웨스턴 블롯 분석 (섹션 6.1 및 6.2 참조) 나누어지는 15 μl의 상층 액. 하룻밤 (1000 희석 1) 희석 허 마우스 단일 클론 항체로 인한 막 프로브. </li></ol> RBP의 검증 6. 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 표준 기술을 이용하여 SDS-PAGE에 의해 분리 RBPs. </li><li> 우리를 실시선미 관심의 RNA와 관련된 RBPs에 대한 프로빙에 의해 표준 기술을 사용하여 블로 팅. 주 :이 데모 실험에서 허 마우스 모노클로 날 항체 허 단백질의 면역 검출에 사용되었다. </li><li> 희석 허 항체 생성 된 막 품어 : w / V의 탈지 분유, 1 배 TBS 5 % (1 천 희석) 0.1 % 트윈 - 20 (4)에서 하룻밤, 부드러운 진탕 C를 °. 1X TBST로 막 세 번 씻으십시오. 1 시간 동안 실온에서 (항 - 마우스 IgG-HRP 염소) 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션. 워시 막. 개발 및 기록 신호. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

lncRNAs 및 RBPs 그러나 이러한 분자의 분자 메커니즘을 제대로 이해, 건강과 질병에 중요한 역할을합니다. lncRNA 분자와 상호 작용하는 단백질의 식별 규제 메커니즘을 해명을 향한 중요한 단계입니다. RNA의 풀다운 분석 시스템에 의한 RBPs의 보충은 세포 용 해물로부터 단백질을 선택적 스트렙 자성 비드에 결합 된 비오틴 RNA 베이트를 사용하여 추출 될 수 있도록 복잡한 상호 작용의 인 용액 캡쳐에 ...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
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Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs 세포의 이중 또는 단일 가닥 RNA에 결합하여 RNA - 단백질 복합체 형성에 참여하는 단백질이다. RBPs는 mRNA의 긴 비 암호화 RNA를 (lncRNAs)를 포함하는 RNA 종의 다양한 결합 및 전사 후 수준에서 자신의 영향력을 행사할 수있다. 두 RBPs 및 lncRNAs은 지방 개발 등 새로운 규제를 신흥 1,2,3 작동된다. 이 특정 RNA 분자와 하나 이상의 RBPs 사이의 상호 작용을 검출하는 것이 필요는 RBP- 메커니즘 및 세포질 통로의 lncRNA 매개 규제를 이해하고, 때로는 RNA의 단백질 파트너의 전체 스펙트럼을 식별 할 성적 증명서. 그러나, 실험에 의한 지방 세포에서 지질의 높은 함량에 어려울 수있다. 여기에 설명 된 RNA 풀다운 프로토콜 4,5 차 배양 지방 세포의 용 해물에서 특정 RNA의 단백질 파트너를 검색하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토에 대한 이론적 근거다음 COL 요약된다. RNA를 미끼는 DNA 주형으로부터 전사 된 시험관에, 비오틴 - 표지 된 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 자성 비드 (4)과 공액. RNA를 미끼이어서 자기 스탠드에서 내려 오게되는 RNA 단백질 복합체의 형성을 허용하는 세포 용 해물과 배양된다. 구체적으로는, RNA 풀다운 프로토콜은 후술 허 단백질 일차 배양 theadipocytelysate에서의 mRNA의 3&#39;UTR 6,7 결합 보편적 RBP 발현을 검색 미끼 AR 3&#39;UTR로부터 RNA 단편을 사용한다. 이 분석의 결합 특이성을 테스트하려면, 비 관련 RNAas 아니라 빈 스트렙 타비 딘 비드 제어 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 특정 RBP의 포착을 확인하거나 캡처 RBPs 각각 8의 전체 레퍼토리를 식별하는 웨스턴 블 롯팅 또는 질량 분석기 (MS)와 호환된다. 몇 가지 기술은 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다에스. 주어진 RBP, RIP (RNA의 면역)와 CLIP (UV 가교 및 면역)에 구속 RNA를 공개하기 위해하는 것은 적용 할 수 있습니다. 반대로, 소정의 RNA의 단백질 파트너를 식별하기 위해, RNA 풀다운는 처프 (RNA 정제하여 염색질 분리) CHART (RNA 타겟 캡처 혼성화 분석)와 RAP (RNA 안티센스 정제)에 적용될 수있다. 나중에 사람과 비교하여, RNA 풀다운 기술은 설정하는 작은 노력이 필요합니다. 생체 외 및 생체 내에서 단백질을 포착하기 위해 사용될 수있다. 그 시험관 대응보다 기술적으로 더 도전 RNA 풀다운,의 생체 방법은 세포에서 가교에 의해 RNA 단백질 상호 작용을 유지, 세포로부터 관심의 앱 타머 - 태그 RNA를 캡처하고,이어서 바인딩 RBPs를 감지합니다. RNA 풀다운 낮은 풍부한 RBPs 농축 및 분리 및 세포 조절을 제어 9,10 다양한 기능적 역할이 RNA 단백질 복합체를 식별하기 위해 사용될 수있다 </s&gt;입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Major materials used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway spin columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major equipment used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotator Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO,Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA 결합 단백질 (RBPs)은 지방의 개발 및 기능의 규제 계층으로 부상하고있다. RBPs 대상의 mRNA의 안정성 및 병진 효율에 영향을 미치는하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 역할을한다. RNA 풀다운 기술은 널리기구 RBPs &#39;아니라 긴 비 코딩 RNA를&#39;(lncRNAs) 함수를 기초 해명 할 필요가 RNA - 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 지방 세포에서 높은 지질 풍요 로움이 실험 수행에 기술적 인 도전을 포즈. 다음은 자세한 RNA 풀다운 프로토콜은 기본 지방 세포 배양에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체의 (AR) 3 &#39;번역되지 않은 지역 지방 세포 lystate에서의 RBP 파트너, 허 단백질을 검색하는 방법을 보여주기 위해 예를 들어 사용되는 아데 닐 - uridylate 풍부한 elementwas를 포함 (3&#39;UTR)에서 RNA 조각. 여기에 설명 된 방법의 상호 작용을 검출하기 위해 적용될 수있다RBPs 및 비 암호화 RNA를,뿐만 아니라 사이 RBPs 및 코딩 RNA를.

데모 실험에서, AR RNA 단편은 결합 단백질 허 캡처 미끼로서 사용 하였다. 모두 허 단백질 비 관련있는 플로리다 RNA 미끼 ​​및 접합 빈 스트렙 타비 딘 비드의 분취 량은 부정적인 컨트롤을 제공합니다. RNA - 단백질 상호 작용은 핵 또는 세포질 중 발생할 수 있으며,이 풀다운 프로토콜 또는 총 분획 (핵 또는 세포질) 세포 용 해물 중 하나에 적용될 수있다. 웨스턴 블로 팅?...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA 풀다운 프로토콜은 RNA 결합 단백질 (RBPs) 및 비 암호화뿐만 아니라 코딩 RNA를 사이의 상호 작용의 검출을 위해 여기에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체 (AR)에서 RNA 조각은 차 갈색 지방 세포의 lystate로부터 RBP를 검색하는 방법을 보여주기 위해 예로서 사용되었다.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; RNA 풀다운

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K 조회수.  Duke-NUS Medical School.  RNA 풀다운 프로토콜은 RNA 결합 단백질 (RBPs) 및 비 암호화뿐만 아니라 코딩 RNA를 사이의 상호 작용의 검출을 위해 여기에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체 (AR)에서 RNA 조각은 차 갈색 지방 세포의 lystate로부터 RBP를 검색하는 방법을 보여주기 위해 예로서 사용되었다. 

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

연구

유전학

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

생화학

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

암 연구학

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

RNA 결합 단백질의 검출에 의해

요약

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