우리는 중요한 읽기와 의견을 제공하는 사라 딕 감사드립니다. MAR는 분자 유전학의 캐나다 연구 의자를 보유하고 하워드 휴즈 의학 연구소의 국제 연구 학술 수 있습니다. 이 작품은 국립 보건원, 하워드 휴즈 의학 연구소, 건강 연구의 캐나다 연구소, 근육질 영양 장애 협회와 캐나다 연구 의자 프로그램에서 MAR에 대한 교부금에 의해 지원되었다.

모든 실험은 동물 보호 및 취급에 대한 오타와 규정의 대학에 따라 처리했다. 프로토콜의 개요 표 1을 참조하십시오. 1. 절연를 시작하기 전에 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : 0.2 % Collagenase 유형 DMEM에서 I (Dulbecco의 수정 이글 배지, 110 MG / ML 나트륨 pyruvate 높은 포도당, L-글루타민). 이 편집 판단리스트 근육 DMEM의 0.2 % Collagenease 2 ML을 준비하십시오. 0.22 μm 필터를 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. 37 번 prewarm 분리하기 전에 10 분, ° C 물 목욕 인치 undiluted collagenase의 추가 aliquots는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 냉동 할 수 있습니다. 참고 : 프로 시저의 모든 걸쳐 나트륨 pyruvate로 DMEM을 사용합니다. 섬유는 나트륨 pyruvate없는 매체에 살아남지 못할 거요. <ul><li> 세탁 미디어 (모든 세차를 수행 할 수 있습니다). 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완. 0을 필터사용하기 전에 0.22 μm 필터. </li><li> Myofiber 문화 미디어. 20% FBS, 1 % 닭 배아 추출물과 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완. 사용하기 전에 필터 0.22 μm을 통해 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 코팅 요리를 Matrigel. 오랜 기간 동안 문화 섬유로, 우리는 코팅 기판으로 Matrigel를 사용하는 것이 좋습니다. Matrigel 코팅 요리를 준비하려면, 4 ° C 하룻밤에 Matrigel의 나누어지는을 해동. 하루를 보낸 후, DMEM에 Matrigel 1시 10분을 희석. 항상 ° 4에서 C를 Matrigel을 유지하고이 고르지 코팅의 결과로 Matrigel 솔루션 내에서 미세한 크리스탈을 만들 것이기​​ 때문에 갑작스런 온도 변화를 피하십시오. 장소 요리는 얼음에 코팅 될 수 있습니다. 표면을 충당 할 충분한 볼륨 코트 요리. 가 1 분에 앉아 보자. 완전히 남은 Matrigel을 제거합니다. 사용하기 이전 또는 밤 적어도 3 시간에 37 ° C에서 요리 건조 보자. </li></ul> 참고 : 4 &amp; 드에 저장된 경우 희석 Matrigel의 aliquots는 코팅 목적으로 여러 번 다시 사용할 수 있습니다g, C. </li><li> 마지막으로, 70 %의 에탄올과 현미경 역 해부 도구를 청소해야합니다. </li><li> 두 가지 편집 판단리스트 isolations (한 마우스는) 다음과 등 5 플라스틱 배양 접시를 (60 * 15mm) 준비에 대해 <ul><li> 절연을위한 네 가지 요리 (근육 분리 1, 직렬 세차 3). 모든 요리는 플라스틱에 붙이는 myofibers을 방지하기 위해 말 혈청 (HS)로 코팅되어야합니다. 코트에, 각 요리, 소용돌이에 말 혈청 피펫 3 ML에도 코팅을 허용하도록, 말 혈청을 제거하고 적어도 30 분의 음식이 건조 보자. 각 요리에 DMEM 4 ML을 추가합니다. 사용하기 전에 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 요리를하세요. </li></ul> 참고 : 살균 보관하면 말 혈청가 여러 번을 다시 사용할 수 있습니다. 또한, DMEM에 10 %의 HS의 솔루션은 코트 요리에 사용할 수 있습니다. 전체 프로토콜을 통해 HS 코팅 요리를 사용하여 부동 조건에 때 배양의 myofibers. <ul><li> 한 접시는 분리 한 후 문화 myofibers에 사용됩니다. Alt 키ernative 접시 크기 나 형식은 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 myofibers의 마지막 문화 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 60 * 15mm보다 큰 접시 크기를 제안하지 않습니다. 하이퍼 수축이 발생하기 전에 Myofibers는 더 이상 96 시간에 정지에 보관하실 수 있습니다. 더 이상 문화 회, 우리는 Matrigel 코팅 요리 나 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ul></li><li> myofiber 조작을위한 근육 처리 및 작은 구멍에 피펫에 대해 하나의 큰 구멍 피펫 : 하나 섬유 절연 (2 편집 판단리스트)의 경우 두 개의 무균 파스퇴르 피펫을 준비합니다. 원하는 길이와 피펫의 가장자리를 부드럽게하기 위해 열 폴란드어 각 유리 피펫을 잘라 다이아몬드 펜을 사용합니다. 불을 사용하여, 작은 구멍 피펫의 곡선 끝. 이 단일 섬유를 처리하는 데 도움이됩니다. 살균하는 화염. 사용하기 전에 HS와 코트는 각 피펫. </li></ol> 2. 근육 절개와 소화 <ol><li> Rosa26TdTomato (;이 실험의 목적은, 8 일주일 정도 SV129, Pax7 CreER Cklr에 대한Pax7Cre - TdTomato)와 Myf5-Cre, Rosa26YFP가 사용되었습니다. </li><li> 70 % 에탄올로 두 다리를 스프레이. 절차 동안 뒷다리의 더 나은 이해가 지원 보드에 동물 (얼굴까지)를 핀. </li><li> 가위의 도움으로 다리의 전체 길이를 잘라 내고 근육을 쉽게받을 수 있습니다. 피부뿐만 아니라 머리카락이나 털 (그림 1A)를 제거합니다. </li><li> 좋은 가위로 기본 근육을 손상시키지 않고 얇은 근막을 잘라. 시각은 편집 판단리스트를 현지화. 편집 판단리스트는 단지 Tibialis 앞쪽 (TA) 근육 아래에있는 뒷다리의 앞 칸에서 발견됩니다. </li><li> 이 집게의 도움으로 말초 힘줄을 쉽​​게받을 수 있습니다. </li><li> 날카로운 Cohann - Vannas 봄 가위로 말초 힘줄을 (TA 및 편집 판단리스트 모두) 자른다. </li><li> 포셉의 도움은 힘줄의 TA 및 편집 판단리스트 근육을 모두 보유하고 섬세 근위 끝 부분의 근육을 당겨와 함께. 이 시점에서 당신은 명확하게 볼 수 있어야합니다단지 TA 근육 아래에있는 편집 판단리스트 근육. 이제 반대 방향 (그림 1B)에 두 힘줄을 당겨 TA 근육에서 편집 판단리스트를 구분합니다. 이 myofibers를 손상시킬 수로이 작업을 수행하는 동안 편집 판단리스트 근육을 스트레칭하지 마십시오. </li><li> 편집 판단리스트 힘줄을 쉽​​게받을 수 있습니다. 더 나은 근위 힘줄을 시각화하기는 TA 근육을 제거하는이 시점에서 도움이 될 수 있습니다. 또한 무릎 주변의 일부 결합 조직 (그림 1C)을 차단하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 근위 힘줄을 잘라 조심스럽게 편집 판단리스트를 (그림 1D)를 제거하십시오. </li><li> 의 힘줄을 통해 근육을 잡고, 이전에 준비 collagenase 솔루션 2 ML로 전송할 수 있습니다. 물 욕조에 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 성공적인 섬유 절연을 위해, 그것은 myofiber 무결성이 유지 될 수 있도록 힘줄의 힘줄에 편집 판단리스트를 분리하는 것이 중요합니다. 2.3-2.9 단계는 해부 현미경으로 수행 할 수 있습니다. 또한, magn의 사용유리를 ifying하면 근육의 더 나은 전망을 즐기실 수 있습니다하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 두 번째 편집 판단리스트를 분리 할 수​​ 2.3-2.9 단계를 반복합니다. 같은 관에서 두 번째로 편집 판단리스트를 전송합니다. 고르지 소화를 방지하려면 두 번째 편집 판단리스트의 고립은 첫 번째 이후 더 이상 5 이상 분을 완료해야한다. 주 1 : 부화 시간이 collagenase 활동에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 긴 또는 짧은 부화는 크기, 연령 및 / 또는 근육의 상태 (예 : fibrotic 근육이 더 소화 시간이 필요합니다)에 따라 요구 될 수 있습니다. 주 2 : 근육 소화 시간 동안 정지 조건 하에서 교반을 위성 세포의 행동을 검토하는 것이 위성 세포 10 달러를 활성화 않을 수 있습니다. </li><li> 소화 기간 동안 정기적으로 오버 소화을 피하기 위해 근육을 확인합니다. 근육 긴장을 푸 시작하고 myofibers가 표시되는 경우 소화를 중지합니다. 소화를 중지하려면 신중하게 DME​​M 4 ML (dissociati과 prewarmed 페트리 접시에 두 근육을 전송요리에). 이 작업을 수행 할 수있는 큰 구멍 크기 피펫을 사용합니다. 참고 : 하이퍼 계약을 체결 myofibers의 고립이 필연적 결과로 근육 overdigestion를 피할 수 있습니다. </li></ol> 3. 싱글 Myofiber 해리와 문화 <ol><li> myofibers를 공개하려면, 섬유 자연적으로 출시되기 시작 때까지 따뜻한 매체 근육을 내리려고 큰 구멍 유리 피펫을 사용합니다. 이 필연적으로 피해 섬유를 얻을 수 있습니다로 근육을 씹다하지 마십시오. 이것과 해부 현미경으로 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 원하는 숫자에 도달 할 때까지 myofibers를 공개 계속합니다. 요리 더 이상 10 분 동안 실온에서 필요한 경우 37 번 5 분 (최소) 부화 ° C, 5 % CO 2 매체를 다시 평형 할 수 할 수 있습니다. 참고 : 매체는 오랜 시간에 생리 이하의 온도 (37 ° C)에 도달하면 myofibers이 죽는 것입니다. </li><li> 작은 크기 구멍 피펫, transfe를 사용하여R은 새로운 prewarmed 요리 (3 연속 세차의 첫 번째)에 단일 myofibers을 살고 있습니다. 대신 모두 한 번에 myofibers의 대량 전송 개별적으로 myofiber를 처리합니다. 필요한 경우, 37에서 배양 ° C, 매체를 다시 평형하는 10-15 분에 대한 5 % CO 2. </li><li> 2 번에 대한 단계 3.3 반복 또는 모든 죽은 myofibers 및 찌꺼기가 제거 될 때까지. 우리는 적절한 청소를위한 최소한 세 연속 세차를 사용하는 것이 좋습니다. 참고 : 짧은과 하이퍼가 현미경 빛 아래에서 계약으로 죽은 myofibers가 나타납니다. </li><li> 37 단일 myofibers을 길러 ° C, 이전에 문화 매체로 전환 적어도 하나의 시간에 대해 마지막 세탁 요리 (단 DMEM)에서 5 % CO 2. 이 myofibers의 혈청이 없으면 체외 조건에 적응 할 수 있습니다. 우리는 혈청 풍부한 중간 섬유 축소 증가에 myofibers의 즉각적인 문화를 발견했다. </li><li> 한 시간 후, 새로운 prewarmed 요리 또는 적절한 문화 형식으로 myofibers 전송다운 스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 높은 혈청 중간에 문화 섬유는 위성 세포 활성화를 허용합니다. 또한, 혈청 또는 닭 배아 추출물의 다른 농도도 사용할 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다. </li></ol> 4. 다운 스트림 응용 <ol><li> Immunostaining. 라이브 myofibers은 고립 동안 시점에서 고정과 스테인드 할 수 있습니다. Immunofluorescence는 플로팅 및 기판에 연결된 두 myofibers에 수행 할 수 있습니다. 부동 myofibers 얼룩 경우, 하나의 솔루션에서 myofibers를 전송할 작은 구멍 유리 피펫을 사용합니다. 또한, 모든 절차를 통해 같은 우물에 myofibers를 유지하고 유리 피펫을 사용하여 솔루션을 추가 / 제거 할 수 있습니다. 이뿐만 아니라 myofibers의 제거가 발생합니다 같은 표준 흡인하지 마십시오. 간단히 완전히 배양액을 제거, 5 분에 prewarmed 4 % paraformaldehyde (PFA)의 수정 myofibers. 광범위하게 PBS 여러 번 씻는다. IncubaPBS 또는 기타 표준 담금질 솔루션에 1% 글리신의 테 myofibers는 PFA 배경 착색을 최소화합니다. 필요한 경우와 0.1 % 트리톤 PBS에서 5 분 세척 한 다음 10 분을위한 PBS에서 X-100. myofibers을 permeabilize 1 실의 온도에서 시간 또는 바람직 박 4 ° C.에 대한 차단 솔루션 섬유 (10 % 말 혈청, 0.1 % 트리톤 X-100, 1 % 할머니를) 품다 대체 차단 솔루션은 관심 항체에 따라 사용할 수 있습니다. 5 분을 위해 PBS에 한 번 씻으십시오. 4 ° C.에서 1 상온에서 시간 또는 야간에 차단 솔루션에 희석 적절한 기본 항체를 품다 모든 언 바운드 항체를 제거하는 PBS에 세척 당 5 분에서 섬유에게 3 번 씻으십시오. 실온에서 45 분으로 1 시간에 해당하는 보조 항체를 품다. PBS에 세척 당 5 분에서 3 번 씻으십시오. 1 MG / ML DAPI로 핵을 Counterstain. 부동 섬유를 얼룩 경우, 현미경에 적합한 유리 슬라이드에 각각의 섬유를 전송할 수 있습니다. PBS 또는 매체의 초과를 제거합니다. 메디 장착 적용음 ... 다음 coverslip을 추가합니다. 형광 현미경으로 myofibers를 시각적으로 진행합니다. 편집 판단리스트 myofibers의 대표 immunofluorescence에 대한 그림 4를 참조하십시오. 강한 fixatives를 사용하여 다른 착색 절차 Verma, M. 외. 11 Wosniak, AC 외. 12에 설명되어 있습니다. </li><li> Oligonucleotide 또는 플라스미드 과도 transfection. 라이브 myofibers는 특정 유전자 / 관심 s의 플라스미드 또는 siRNA와 transfected 수 있습니다. siRNA를 사용하는 경우, 두 transfection는 효율적인 유전자 최저 권장합니다. 우리는 고립에서 8 시간 후 첫 transfection을 수행하는 것이 좋습니다. transfection 후 여섯 시간은 신선한 매체로 대체합니다. siRNA의 transfection 위해, 우리는 50 nm의 최종 농도를 사용하여 시작하는 것이 좋습니다. 유전자 표현 최저는 RNA 추출 또는 바람직 immunostaining에 의해 분석 될 수 있습니다. </li><li> 바이러스 감염. 라이브 myofibers의 감염이 가능하지만, 세포의 발생죽음이 oligo의 transfection과 감염의 효율성과보다 높은 것은 근육 상태와 나이에 따라 변수가 될 수 있습니다. 예를 들어, 그대로 성인 근육 myofibers는 호스트 감염 13, 14에 대한 보호 장벽을 제공하기 위해 표시되었습니다 기저 얇은 판의 존재로 인해 바이러스 감염에 대응 특히 비입니다. 그들은 동작 (비 mitotic) 세포를 감염 될 수 있기 때문에 Lentiviral 벡터는 retroviral 벡터 선호하고 있습니다. 바이러스 감염를 들어, Matrigel 코팅 접시 플레이트와 myofibers는 첫 24 시간에 대한 미디어 환경에 적응하게에 문화 섬유에 좋습니다. </li><li> 영상을 살고 있습니다. myofibers의 영상은 특히 시간이 소요되며, 37 ° C, 5 % CO 2 챔버가 장착 된 현미경을 필요로 살고 있습니다. 하나의 위성 세포의 행동을 평가 때 유용합니다. 이 기술을 사용하여 수행 작업은 위성 세포 이질성의 발견에 대한 역할을했습니다하고 beha을 공부하기섬유 vior (15, 16). </li></ol>

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그대로 근육의 단일 myofibers의 절연 및 문화 근육 재생의 과정을 공부하는 체외 모델에 우수한를 제공합니다. 이 시스템의 고유 기능은 기저 얇은 판 아래의 생리적 환경에서 위성 세포의 보존입니다. 가장 중요한 기술은 정지하고 활성 상태 모두에서 근육 줄기 세포의 행동을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 지난 20 년 동안 myofiber 문화 시스템은 고유 및 외부 determinants 모두에 대해 위성 세포 인구의 생물에 의미있는 통찰력을 제공하고 있습니다. 배양 개인의 myofibers으로 myofiber, 근육 입력하거나 재생 가능성과 관련하여 위성 세포 이질성은 15 해결되었습니다. 위성 세포 이주 패턴 16 획득 정보를 허용 한 배양 섬유의 라이브 영상을 사용하여 정교한 연구. 양적 데이터의 취득은수 LSO. 시간이 많이 있지만, 특정 이벤트 (줄기 세포 비대칭 분할, 증식과 분화 비율 등)의 유통 및 발생에 관한 중요한 정보를 제공합니다. FACS 또는 기타 수단으로 위성 세포의 순수한 인구의 분리는 분자 수준에서 단백질이나 유전자 표현 변화를 조사 할 수있는 좋은 플랫폼을 제공 할 수 있지만 함께 이전에 설명 된 응용 프로그램과 단일 섬유에서 단백질이나 RNA 추출도 가능합니다. 우리의 경험에서 성공적인 섬유 절연을위한 가장 중요한 단계는 절연 (2.5-2.9 프로토콜 텍스트의 단계) &quot;힘줄에 힘줄이&quot;입니다. 이 근육 소화 한 후, 섬유 최소한의 또는 전혀 손상이 때문에 다음 단계에서 자신의 성능을 증가와 함께 편집 판단리스트에서 해제되어 있는지 보장합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 / 재료 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C0130-1g </td><td> 최적의 결과를 신선한 모든 시간을 준비합니다. undiluted collagenase의 추가 aliquots는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> DMEM 높은 포도당 + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> 펜 / 패 혈성의 추가는 대기 contaminations을 최소화 할 필요가 있습니다 </td></tr><tr><td> 특징 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> 롯 # KUJ35152 </td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> 롯 # AVJ82494 </td></tr><tr><td> 닭 배아 추출 </td><td> 정확한 화학 </td><td> CE-650-T, 배치 B7035010 </td><td> 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> -20 ° C.에 저장 aliquots 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. 4 ° C.에 희석 aliquots를 저장 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> Cohann - Vannas 봄 가위 블레이드 - 스트레이트 - 샤프 6mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 씬 아이리스 가위-10.5cm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> 모리아 - 홍채 집게가 구부러진 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> 파스퇴르 피펫 </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> 다이아몬드 펜 </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm 페트리 접시 </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0.22 μm 필터 </TD&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 StemiV6을 해부 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> 추가 광원이 더 나은 초점 전경을 조망하실 수 있습니다해야 할 수 있습니다 </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

성인의 근육 재생은 위성 세포라고 주민 줄기 세포에 의해 수행됩니다. 위성 세포는 기저 얇은 판 각 myofiber의 sarcolemma 사이에 자신의 위치에 의해 정의됩니다. 자신의 행동의 현재 지식은 크게 단일 myofiber 격리 프로토콜의 사용에 의존하고 있습니다. 1985 년에 비 쇼프는 myofiber과 줄기 세포 사이의 물리적 연결이 1 보존되는 체외 시스템에를 만드는 것을 목표로 성인 쥐의 Flexor Digitorum Brevis (FDB)에서 하나의 라이브 섬유를 분리하는 프로토콜을 설명했다. 1995 년 비 쇼프 프로토콜 등이 myofibers이 단독으로 데려와 대신 중력 침강 2, 3 분리되는 collagenase를 소화 한 후 별도로 처리됩니다를 Rosenblattmodified. Rosenblatt 또는 비 쇼프 프로토콜은 이후 다른 근육, 연령이나 조건 3-6에 맞게되었습니다. 단일 myofiber 절연 기술은 필수입니다독특한 장점 때문에 도구입니다. 첫째, 단일 myofiber 프로토콜에, 위성 세포는 기저 얇은 판 아래에 유지됩니다. 이러한 형광 활성화 셀 정렬과 같은 다른 기술을 화학 및 기계적 조직 분리 7 필요로이 프로토콜의 독특한 기능입니다. myofiber 문화 시스템은 생체 연구에 대한 대체 할 수 있지만 근육 줄기 세포의 관련 생물학적 속성을 처리 할 수있는 뛰어난 플랫폼을 제공 않습니다. 싱글 myofibers는 표준 도금 조건 또는 부동 조건에서 배양 할 수 있습니다. 부동 myofibers에 위성 세포는 myofiber 환경보다 거의 다른 어떤 영향을 받게됩니다. 기판 강성 및 코팅은 근육 8, 9를 다시 생성 할 수 위성 세포 &#39;능력에 영향을 표시 한 것도 이러한 요소의 각을 제어 할 수있는 것은 독립적으로 할 수 있습니다 틈새 시장에 의존하고 독립적 인 반응 사이의 차별. 혈청의 다른 농도가또한 정지에서 활성으로의 전환에 영향을 가지고 표시되었습니다. 관련 위성 세포의 정지 상태를 유지하려면 섬유는 1-3 낮은 혈청 매체에 보관해야합니다. 정지 상태에 관련된 유전자를 연구 할 때 특히 유용합니다. 혈청 풍부한 매체에, 위성 세포가 빠르게 활성화, 따라서 1-3 생체 재생 과정에를 모방, 마이그레이션 및 차별화, 세포 분열 따위에 의해 번식. 바이러스 배달 유전자의 이소성 표현; oligonucleotide 기반의 유전자 똑 다운 또는 라이브 이미징 시스템은 이러한 화학 억제제의 테스트와 같은 assays의 다양한을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 문서는 현재 성인 마우스 (6-8주 이전)의 신근 Digitorum의 Longus (편집 판단리스트) 근육에서 단일 myofibers를 분리하기 위해 실험실에서 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

여기 성인 마우스의 편집 판단리스트 근육에서 단일 myofibers의 절연을 설명했다. 성공적인 myofibers는 collagenase 활동이나 근육 조건이나 연령 등 여러 가지 요인에 따라 달라집니다를 얻을 수 있습니다. 가장 중요한 건에서 편집 판단리스트 근육의 길이 그대로 myofibers의 힘줄이 결과 근육의 고립. 그림 1은 고립 &quot;힘줄에 힘줄이&quot;의 단계 그래픽 표현을 통해 단계를 보여줍니다. 근육이 완전히 소화되면 myofibers는 근육에 부드러운 압력을 적용하여 출시하고 있습니다. 그림 2A는 첫 번째 세척 후에 myofiber 격리 실험의 대표 사진을 보여줍니다. 이 시점에서 문화는 길고 빛나는 관 구조로 표시 한 myofibers 묶음의 혼합물을 포함, 하이퍼은 소화 과정에서 어둡고 짧고 파편 아르 myofibers을 계약. 적어도 세 연속 세차의 끝으로 만 하나의 라이브 myofibers는 디에 남아 있어야문화 또는 다운 스트림 분석을위한 쉬 (그림 2B). 그림 2C는 하이퍼 계약을 체결 섬유 (C &#39;)에 비해 긴, 라이브 섬유를 보여줍니다. 고립시, 위성 세포는 myofiber 표면 (그림 3A)에 작은 protuberances으로 나타납니다. 혈청 풍부한 매체에 유지하는 경우, 위성 세포는 활성화 분아 따위에 의해 중식, 마이그레이션 결국 myotubes (B)에 융합. 문화 15 일이 지나면 모든 myotubes는 성인의 근육 재생이 자신의 개발 기간 동안 어떤 시점에서 myogenic 결정자 계수 Myf5을 표명했다고 세포에 의해 수행되는 제안 Myf5 기자 YFP (C)를 표현한다. 모든 객실에는 위성 세포는 짝을 상자 전사 인자에게 Pax7 17 표현한다. 기자 마우스 라인 Pax7Cre-TdTomato는 TdTomato 형광 신호 (그림 3D 및 E)의 표현을 통해 위성 세포를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 그림은 4 쇼 대표 immu더블 Pax7 + / Myod 위성 세포의 nofluorescence. 클래식 한 더블 Pax7 + / Myod + 위성 세포는 하나 다운 Myod을 조절하고 Pax7 표현 18 유지하여 Myod 표현하거나 정지로 수익을 유지하면서 다운 Pax7을 조절하여 차별화 프로그램을 완료 proliferative 헌신적 인 근육 progenitors로 간주됩니다 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. 마우스 hindlimb에서 편집 판단리스트 근육 절연. 8 일주일 정도 성인 마우스. Hindlimb. 화살표는 말초 (무릎) 힘줄과 인접 (도보) 힘줄을 나타냅니다. B는. Tibialis 앞쪽 (TA) 근육과 신근 Digitorum의 Longus (편집 판단리스트) 근육. C의 해부 위치. 근위 힘줄을 통해 편집 판단리스트를 개최함으로써, 근육은 말초 힘줄이 노출 무릎쪽으로 당겨 있습니다. D는. 말초 힘줄은잘라 내기 및 편집 판단리스트가 공개되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 하나의 myofiber 격리 실험의 대표 결과입니다. 첫 번째 세척 단계에서 myofiber 격리 실험. 밝은 현장 사진. 레드 화살표가 라이브 myofibers을 나타냅니다, 흰색 화살표가 하이퍼 계약 myofibers을 나타내며 노란색 화살표는 세포, myofiber 또는 ECM의 파편을 나타냅니다. B는. DMEM의 연속 세차 후에는 라이브 myofibers이 남아있다. C와 C &#39;. 이미지 긴 그대로 라이브 myofiber (C)를 ​​상징하며 짧은 하이퍼가 myofiber을 (C &#39;) 계약을 체결. 바 10 μm. 사진은 AxioCam HR 갖춘 Zeiss Axio 옵저버 Z1 현미경으로 촬영 된 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="그림 3"/> Figur<html> E 3. 하나의 myofiber 문화 실험의 대표 결과입니다. 바로 분리 한 후 관련 위성 세포 (화살표) (시간 0). B와 하나의, 라이브 myofiber의. 밝은 현장 사진. 싱글 myofibers는 Matrigel에 도금 15 일 혈청 다양한 매체에 배양 하였다. 화이트 화살표는 하나의 셀 (노란색 화살표) C에 비해 차별화 된 myotubes을 나타냅니다. Myf5Cre에서 싱글 myofibers는, RosaYFP 마우스는 B와 같이 배양되었다. 화살표 Myf5 파생 myotubes을 나타냅니다. D와 E. Pax7Cre에서 싱글 myofibers, TdTomato는 바로 한 후 격리하고 수정되었습니다. 화살표는 Pax7 긍정적 정지 위성 세포 (E, 빨간색)을 나타냅니다. 핵은 DAPI (D)와 counterstained되었습니다. 바 : 50 μm. 사진은 AxioCam HR 갖춘 Zeiss Axio 옵저버 Z1 현미경으로 촬영 된 것입니다. 방법 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="그림 4"/> 4 그림. myofibers 위성 세포의 immunofluorescence 얼룩의 예. 싱글 myofibers는 절연 및 플로팅 조건에서 72 시간에 배양 하였다. myofibers에 위성 세포는 위성 세포 특정 마커 Pax7 (B, 빨간색)와 myogenic 규제 요소 Myod (C, 녹색)에 얼룩이되었습니다. 핵은 DAPI (A)와 counterstained되었습니다. 바 : 50 μm. 사진은 AxioCam HR 갖춘 Zeiss Axio 옵저버 Z1 현미경으로 촬영 된 것입니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 근육 절개 (5 분 각각의 근육) </td><td><ul><li> 힘줄이 고립 건 </li><li> 샤프 도구 </li><li> 최소 근육 손상 </li></ul></td></tr><tr><td> 근육 소화 (30-45 분) </td><td><ul><li> 온도민감한 </li><li> overdigestion을 피 </li></ul></td></tr><tr><td> 섬유 절연 </td><td><ul><li> 섬유의 조작을 통해 피 </li><li> 여러 세차와 파편을 제거 </li></ul></td></tr><tr><td> 섬유 문화 (최대 3~4주까지) </td><td><ul><li> 형식 : 모든 </li><li> 코팅 : 말 혈청, Matrigel </li><li> 매체 : 기초 또는 혈청 높은 </li></ul></td></tr></tbody></table> 표 1. myofiber 격리 프로토콜의 개요. myofiber 절연 프로토콜은 4 주요 단계로 구성되어 있습니다. 각 단계에 대해 대략적인 시간과 주요 핵심 포인트를 설명합니다. 각 단계에 대한 자세한 설명은 프로토콜 텍스트를 참조하십시오.

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Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

myofibers의 절연과 문화는 황금 표준입니다<em&gt; 체외에서</em정지, 활성화 및 차별화를 통해 위성 세포의 전환을 공부하기&gt; 시스템입니다. 중요한 것은 하나의 myofiber 문화 시스템은 근육 줄기 세포 틈새의 필수적인 구성 요소입니다 myofiber / 줄기 세포 연결을 유지합니다.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

isolation-culture-individual-myofibers-their-satellite-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

62.1K 조회수.  Ottawa Hospital Research Institute. myofibers의 절연과 문화는 황금 표준입니다 체외에서 시스템입니다. 중요한 것은 하나의 myofiber 문화 시스템은 근육 줄기 세포 틈새의 필수적인 구성 요소입니다 myofiber / 줄기 세포 연결을 유지합니다.

비디오: Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

연구

생물학

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...