사라 A. Alfaqeeh은 치과, 전문대, 교육부, 사우디 아라비아 왕국의 종류 사우드 대학 재정 지원됩니다.

1. 설정 <ol><li> (미네랄 오일로 윤활 숫돌을 사용하여) 해부 도구를 선명하게 및 70 % 에탄올 스프레이 건조 가열 살균을 사용하는 기관 배양을 위해 사용하기 전에 소독. 12 V 공급 장치를 사용하여 2 M 수산화 나트륨을 사용하여 전기 분해 해부 바늘을 선명. </li><li> 1 % 루타와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충 고급 둘 베코의 수정 이글 중간 F12 (DMEM의 F12)으로 구성된 배아 기관의 해부와 문화에 사용되는 배지를 준비합니다. </li></ol> 2. 배아 해부 <ol><li> 홈 오피스 또는 기타 관리위원회가 승인 한 일정 하나의 방법을 사용하여 일정 시간 성관계 임신 여성을 추려. 낮은 복부 주위의 피부를 멀리 해부 가위를 사용하여 복부를 열 컷. 낮은 중간 선에 함께 연결하는 두 개의 자궁 뿔을 찾습니다. </li><li> 얼음 매체로 채워진 튜브에 자궁과 장소를 해부하다. 갔지N 얼음에, 조직은 몇 시간 동안 남아있을 수 있습니다. </li><li> 현미경으로 중간에있는 페트리 접시에있는 자궁과 장소를 제거합니다. 가능한 배아 해부 오염을 최소화하기 위해 층류 흐름 후드에서 수행되어야하는 위치. </li><li> 자궁에서 배아를 해부하고 자신의 배외 (extraembryonic) 조직에서 그들을 해방. </li><li> 텅스텐 바늘을 사용하여 배아를 참살하고 매체의 신선한 접시에 머리를 전송합니다. </li><li> 구강에 바늘을 배치하여 헤드의 턱을 분리하고 머리 뒤쪽 (그림 1A와 1B)으로 극복. 초핑 기다리는 동안 격리 하악골 일시적 얼음 매체에 저장 될 수있다. </li><li> 전체 하악 슬라이스 E11.5-E15.5 치아 세균 배양에 적합하다 스테이지. E15.5 후 하악의 개발 뼈 자르고 너무 어렵다. 치아 조각은 여전히​​ 할 수 있지만 뼈 (치골과 형성 치조골) 먼저 제거해야합니다9 자르고 전에 해부. 텅스텐 바늘과 집게를 사용하여 조심스럽게 뼈를 제거합니다. </li></ol> 3. 배아 슬라이스 <ol><li> 표준 테이블 조직 헬기 (그림 1C)를 사용하여 하악 조직 조각을 준비합니다. 약 200 턱 후 신선한 잎을 사용하고 떨어질 때 설치 디스크와 같은 높이가 놓여 있는지 확인하십시오. </li><li> 설치 디스크를 청소하고 사용하기 전에 70 %의 에탄올로 블레이드. 컴퓨터를 사용할 때 칼날이 매우 날카로운 있으므로주의는주의해야합니다. </li><li> 표본의 연령에 따라 200 ~ 400 μm의 사이의 절단 거리에 헬기를 설정하고 전체 치아 세균이 필요한지 여부에 따라 달라집니다. 최대의 블레이드의 힘을 설정합니다. </li><li> 피펫이나 집게를 사용하여 플라스틱 설치 디스크에 하악을 전송합니다. 방향이 아직 확실 있는지 디스크 만들기에 하악을 정렬합니다. 현상 혀 방향을 결정하기위한 유용한 마크로서 사용할 수있다. 어금니 사용 AF에 대한앞니에 그들은 (그림 2A에 자르고면 참조) 성장이 치아의 서로 다른 방향을 반영하기 위해 하악을 통해 시상 슬라이스를 사용하는 동안 rontal / 가로 방향 (그림 1B에서 자르고면 참조). </li><li> 약간 설치 디스크의 하악골을 건조하기 위해 필터 종이를 사용하여 조직의 주위에서 초과 매체를 제거합니다. </li><li> 즉시 건조 후, 헬기의 원형 스테인리스 테이블에 디​​스크를 놓습니다. 에 컴퓨터를 켜고 키​​를 눌러 시작. 표 동시에 블레이드를 운반 초핑 아암가 발생 / 분까지 200 스트로크 삭제하면서 왼쪽에서 오른쪽으로 자동 이송. </li><li> 조직이 완전히 분리 한 후 컴퓨터의 전원을 끄십시오. 블레이드 암이 발생한 위치에 있는지 확인하고 디스크를 제거합니다. 블레이드 팔에서 손가락을하거나 자르고 때 무인 기계를 방치하지 마십시오. </li><li> 설치 디스크를 가지고 즉시 매체 t을 추가O 순서의 디스크 조각은 과도한 건조를 방지한다. 정중 매체의 소규모 배양 접시 (도 2A)에 텅스텐 바늘 후 피펫을 이용하여 디스크의 바닥으로부터 분리 된 조직을 제거. </li><li> 바늘을 사용하여 조각을 분리하고 입체 (그림 1D, 1E, 및 2B)에서 관심의 조직을 포함하는 조직 조각을 선택합니다. 매체 신선한 배양 접시에서 선택한 슬라이스를 놓습니다. </li></ol> 4. 슬라이스 문화 <ol><li> 탈수를 방지하기 위해 외부 웰에 멸균 물을 약 2 ㎖를 추가하고 요리의 중심에 걸쳐 금속 격자를 배치하여 문화에 대한 준비가 중앙 아니라 장기 배양 접시를 준비합니다 (그림 3a 및 3b). </li><li> 약 4cm 스테인레스 스틸 메쉬 시트에서 1.5 센티미터 x 다음 스트립을 절단하여 금속 그리드를 준비합니다. 중앙에 구멍을 뚫어 구부려 구멍 펀치를 사용하여엇갈린 말을 만들 수있는면. 그리드는 접시 (그림 3a 및 3b)의 바닥에 평행하게 누워, 중앙도에 걸쳐 평면 적합해야한다. 사용하기 전에 소독 그리드를 압력솥. </li><li> 투명 폴리에틸렌 테레 프탈레이트의 조각 그리드에 구멍을 커버하기에 충분한 크기 (PET) 막 (기공 크기 0.4 μm의) 절단. 선택한 슬라이스를 접시에 잘라 막 놓습니다. </li><li> 막 위에 슬라이스를 놓고 조심스럽게 중앙에 평평하게 슬라이스, 매체 밖으로 막을 올립니다. </li><li> 중앙에 원형 구멍을 통해 그리드에 필터를 배치하고, 멤브레인의 수준까지, 웰에 배지의 약 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 조작 (예 8) 매체에 단백질 또는 작은 분자 억제제를 추가하십시오. </li><li> 문화의 날 0시 형태의 레코드의 조각을 촬영하고 있습니다. </li><li> 5 % CO의 가습 분위기에서 요리를 배치 <s인큐베이터에서 37 ° C에서&gt; 2 UB. </li><li> 평균을 7 일 동안 정기적으로 문화를 사진. 문화 매체마다 48 ~ 72 시간을 변경합니다. 촬영을 위해 아래 (그림 2C-E)에서 광원으로 조각을 볼 수 있습니다. </li></ol> 5. 리니지 추적 계보 추적이 요구되는 경우에, 그러한 DII 또는 DIO 같은 친 유성 염료는 단계 4, 슬라이스 배양 전에 치아 세균에 주입 될 수있다. <ol><li> 바늘 풀러를 사용하여 유리 모세관 바늘을 빼냅니다. </li><li> 집게를 사용하여 바늘의 끝을 중단하고 아래로 염료 용액에 팁을 배치합니다. 염료는 모세관 작용에 의해 팁을 채우는 동안 몇 분 동안 둡니다. </li><li> 홀더에 가득 바​​늘을 놓고 인젝터 입 흡입기에 튜브를 통해 연결합니다. </li><li> 표시 될 예정 조각의 영역을 감동 배지에서 바늘의 끝을 배치합니다. 니들 중 염료의 소량 변위 공기압 적용조직에 거라고. </li><li> 바늘을 제거하고 형광에 따라 라벨을 확인합니다. </li><li> 성공적 표지 슬라이스 필터에 전송하고, 단계 4에 설명 된대로 배양 될 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+dental+mesenchyme:+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle.">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li><li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition.">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes &amp; development. 12, 2636-2649 (1998).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li><li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots.">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li><li>Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination.">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li><li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone.">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li><li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mesoderm+to+the+developing+dental+papilla.">Contribution of mesoderm to the developing dental papilla.</a> The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).</li><li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling.">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li><li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions.">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li><li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars.">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li><li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root:+implications+for+Hertwig's+epithelial+root+sheath+formation.">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li><li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse.">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li><li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars:+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells,+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units,+the+cusps.">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li><li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development.">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li><li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme:+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction.">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

치아 배양이 방법은 치아의 세균에 대한 액세스 장점은 정확한 계보가 상피 세포 또는 중간 엽에서 추적 및 구슬의 배치를 허용, 우수한 있습니다. 개발 치아 세균의 정의 영역은 따라서 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다. 배양 중에 치아 세균의 변화 형태는 다음 될 수 있고, 조작의 효과는 빠르게 평가. 이 정확하게 다진 할 수있는 방법은, 그러나, 이러한 덴틴과 에나멜과 ...

실험의 번호는 문화 조직 생체 개발을 따르도록하는 것이 중요합니다. 조직 개발 농경 개발의 정의 기간에 액세스를 제공하고, 배양 배지에 요소를 첨가하여 유전자의 조작, 또는로드 구슬 및 형질 및 일렉트로 하나의 사용에 의해 허용한다. 많은 실험을 위해 그것이 성장함 조직 형태 형성을 겪는다로서 혈통 표지화 된 세포의 운명을 따라, 예를 들어, 조직을 시각화 할 수있는 것이 중요하다. 이 배아에서 조직의 블록을 배양 할 때 분명하지 않은 깊은 배아 내 개발 조직에 특히 문제가 될 수 있습니다. 그들은 하악, 상악과 정면 코 프로세스 내에서 개발로 이빨이 좋은 예입니다. 전체 하악이 배양되면 고정 된 조직으로 구획 한 후, 치아의 표면 구조는 볼 수 있지만, 형태 변화만을 분석 할 수있다 <s업&gt; 2. 우리는 우리가 치아 세균의 개발을 수행 할 수 있도록 개발 중에 치아의 다른 부분에 대한 액세스를 제공하는 라이브 슬라이스 문화 기술을 적용했다. Trowell에서 변성 방법 3을 사용하여 기체 - 액체 계면에서 기술 배양 치아 세균 조각. 이러한 슬라이스 문화를 직접 치아의 형태 형성을 다음과 같은 에나멜 매듭 치과 유두와 여포 1,4-7과 같은 별개의 구성 요소의 혈통 추적을 수있는 매우 유용하고있다. 기술은 마우스 배아에 한정되지 않고 성공적으로 돼지의 배양 라이브 슬라이스 및 뱀 치과 티슈 8,9에 사용되어왔다. 치아 전개를 시각화 할 수 있다는 장점 외에, 슬라이스 방법은 또한 조직의 얇은 조각은 인큐베이터에서 중형 및 공기로부터 영양분에 대한 액세스를 증가 이점을 갖는다. 이것은 생체 내에서 개발을 일치 치아 세균 및 쇼 invas의 개선 된 성장 결과돌기 (7)에 내피 세포의 이온. 반면, 전체 하악 문화 치아 세균 생체 내에서보다 느린 개발하고, 문화의 중심지 장기 문화에 괴사가 많습니다. 슬라이스 문화, 치아는 턱의 조각에서 개발하고 주변 개발 뼈와 다른 조직과의 상호 작용을 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 방법으로 조직을 똑바로 지지체 (10, 11)에 포함 할 필요하고 도마에 조직을 연결하는 모든 시스템에 대한 필요와 절개 후 다진된다. 상기 방법은 많은 턱뼈가 한 세션에서 절개 할 수 있도록, 따라서 비 침습적 신속한이다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101077Y</td>
			<td>100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>Cell-labeling solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geminator 500</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>Thomas No. 3885A20</td>
			<td>Dry-heat sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Standard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 &#956;m pore size)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>PET track-etched membrane, 6-well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>FE228710</td>
			<td>(Fe/Cr18/Ni10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Intracel Ltd</td>
			<td>051-0500-900 0-100 psi</td>
			<td>Single channel picospritzer III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary with filament 1 mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.1 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.38 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>Used for mouth aspiration lineage tracers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the slice culture method for following development of tooth germs in explant culture

이식편의 문화는 특정 시점에서 장기를 개발하고 조작 따라서 발달 생물학을위한 중요한 방법입니다 수 있습니다. 많은 기관의 경우는 체외 배양시 모니터링 할 수 있도록 개발 조직에 접근하기가 어렵습니다. 슬라이스 문화 방법은 수 있습니다 조직에 액세스 할 수 있도록 형태 형성의 움직임이 따라 할 수있는 특정 세포 집단이 조작 또는 계보 추적 대상이 될 수있다. 본 논문에서 우리는 종의 범위에서 치아 세균의 문화에 매우 성공적이었다 슬라이스 문화의 방법을 설명합니다. 방법은 다른 턱 조직으로 둘러싸인 생체 내에서 관찰되는 것과 유사한 비율로 개발 치아 세균에 우수한 액세스를 제공한다. 이것은 치아와 주위 조직 사이의 조직 상호 작용을 모니터링 할 수있다. 이 논문은 치아 세균에 집중되지만, 동일한 프로토콜이 수의 개발을 수행하도록 적용될 수있다이러한 침샘, 메켈의 연골, 코 분비, 혀, 귀 등 다른 장기의.

제 어금니 치과 여포의 움직임에 추종하기 위하여, 250 μM 정면 슬라이스는 상기 한 방법을 사용하여 하악 통해 촬영했다. 치아 뿌리는 개발 치아의 바깥 쪽 에나멜 상피 (OEE)을 둘러싸는 중간 엽의 층이며, 이전에 치주 6의 조직의 형성에 참여하는 것으로 나타났다. 턱은 E14.5, 치아 개발의 캡 단계에서 해부했다. 슬라이스 내의 치과 상피의 윤곽이 맑아 응축 치과 간엽은 치아 상피 세포 <str...

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The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

여기에 디테일이 조직 헬기를 이용하여 하악 조각 문화 치아 세균에 방법을 우리는. 이 방법은 전통적인 배양 방법을 사용하여 사용 가능한 조작과 혈통 추적하지를위한 절호의 기회를 제공하고, 개발하는 동안 치아에 고유 한 액세스 할 수 있습니다.

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K 조회수.  King's College London.  여기에 디테일이 조직 헬기를 이용하여 하악 조각 문화 치아 세균에 방법을 우리는. 이 방법은 전통적인 배양 방법을 사용하여 사용 가능한 조작과 혈통 추적하지를위한 절호의 기회를 제공하고, 개발하는 동안 치아에 고유 한 액세스 할 수 있습니다. 

비디오: The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 랫 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

연구

생물학

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 Biolistic Transfection의 준비

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

회전 형 바틀 문화 시스템을 사용 로던트 전체 엠브료 문화의 방법

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.