이 쉽고 재현 가능한 프로토콜은 건강하고 병든 마우스 모델 간뿐만 아니라 인간 및 비인간 영장류의 간에서 고품질 핵을 분리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법은 소량의 냉동 조직 재료 만 필요합니다. 또한 밀도 등급 인센티브는 최종 핵 준비에서 보존된 간의 모든 주요 세포 유형과 함께 매우 깨끗한 핵 현탁액을 제공합니다.
이 핵 추출 방법은 바이오뱅크에 저장된 바이오 아카이브된 인간 간 샘플에 사용할 수 있습니다. 미리 식힌 메스를 사용하여 드라이 아이스의 페트리 접시에 놓인 간 조직에서 2230 밀리그램 또는 5 밀리미터 큐브 조각을 절단하여 조직 균질화를 시작하십시오. 즉시 페트리 접시를 젖은 얼음으로 옮기고 균질화 버퍼 1 밀리리터를 첨가하십시오.
차가운 메스를 사용하여 가능한 한 조직을 다진 다음 1 밀리리터 너비의 오리피스 팁으로 흡입 할 수 있습니다. 조직 현탁액을 수집하여 미리 냉각된 2밀리리터 유리 도운스 균질화기로 옮깁니다. 페트리 접시를 0.521 밀리리터의 균질화 완충액으로 씻고 모든 것을 얼음 위에 유지하면서 나머지 모든 조직 조각을 수집합니다.
거품을 만들지 않고 얼음 위에 느슨한 유봉 A로 천천히 조심스럽게 5 스트로크를 수행하십시오. 유봉이 각 스트로크마다 균질 기의 상단에서 하단으로 조심스럽게 움직이는 지 확인하십시오. 그 후 거품을 생성하지 않고 얼음 위에 단단한 유봉 B로 10-15 번의 느린 스트로크를 수행하십시오.
완료되면 균질액을 50마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하는 동시에 사전 냉각된 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 다량의 결합 조직 덩어리를 포함하는 균질 액에 대해 하나 이상의 필터 또는 튜브를 사용하십시오. 밀도 구배 원심분리 전에 모든 조직 균질액을 완전히 수집하기 위해 균질화 완충액의 추가 0.521 밀리리터로 균질화기 및 필터를 헹굽니다.
밀도 구배 원심분리의 경우, 여과된 균질액을 섭씨 4도에서 8분 동안 1000G의 사전 냉각된 고정각 원심분리기로 원심분리합니다. 샘플이 원심 분리되는 동안 250 마이크로 리터의 50 % 요오드 딕산올 희석액을 포함하는 1.5 밀리리터 튜브와 500 마이크로 리터의 29 % 요오드 잔산 올 희석액을 포함하는 하나의 2 밀리리터 튜브를 준비하십시오. 두 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
그런 다음 원심분리기 현탁액에서 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡입합니다. 1 밀리리터 너비의 오리피스 피펫 팁을 사용하여 250 마이크로리터의 균질화 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다. 그런 다음 250 마이크로 리터의 핵 현탁액을 250 마이크로 리터의 50 % 요오드 잔올을 포함하는 사전 냉각 된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 부드럽고 철저히 혼합하여 25 % 요오드 산놀 핵 현탁액을 생성합니다.
다음으로, 500 마이크로 리터의 25 % 요오드 딕산올 핵 현탁액을 500 마이크로 리터의 29 % 요오드 산올 희석액을 포함하는 사전 냉각 튜브 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 사전 냉각 된 스윙 버킷 원심 분리기에서 튜브를 12, 500G에서 20 분 동안 원심 분리하고 브레이크를 해제합니다. 원심분리 단계가 완료되기 직전에 단일 핵 RNA 시퀀싱 파이프라인으로 진행하는 동안 RNA 억제제를 핵 저장 완충액 또는 NSB에 추가합니다.
원심분리 완료 후, 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인한다. 1 밀리리터 너비의 오리피스 피펫 팁을 사용하여 100-300 마이크로 리터의 NSB에 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시키고 핵 현탁액을 깨끗한 사전 냉각 된 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 수동 혈구계와 함께 trypan blue 용액을 사용하여 핵을 계수하고 즉시 얻은 핵 현탁액을 단일 핵 유전체학 분석에 사용합니다.
유세포분석 기반 세포 분류의 경우 50마이크로미터 필터를 통해 핵 현탁액을 사전 냉각된 5밀리리터 형광 활성화 세포 분류 또는 팩스 튜브로 여과합니다. 샘플을 미리 보기 전에 100마이크로미터 노즐이 장착된 유세포분석 분류기를 사용하고 팩스 튜브를 분류기에 로드합니다. 핵 정렬을 위한 게이팅 전략을 설정하고, 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역을 플로팅하여 산란 게이트부터 시작하여 가짜 높이 대 가짜 영역, 가짜 너비 대 가짜 영역을 플로팅합니다.
가짜 영역 히스토그램에서 핵 배수성 프로파일을 시각화합니다. 96웰 또는 384웰 플레이트로 분류하려면 액적 지연을 설정하고 색도법을 사용하여 플레이트 정렬을 최적화합니다. 시료 회전을 300RPM으로 켠 상태에서 시료 냉각 및 플레이트 홀더를 섭씨 4도로 설정합니다.
밀리리터당 약 1배 10 내지 5번째 핵의 샘플 농도에서 단일 핵을 초당 200 내지 500 이벤트의 유속으로 분류한다. 냉동 간에서 추출한 핵의 현미경 검사는 밀도 구배 원심분리 단계가 원치 않는 세포 및 조직 파편의 제거를 크게 촉진한다는 것을 보여주었습니다. 이 방법론은 세포 분석 분석에 의해 검증되고 정량화 된 모든 수준의 배수성을 보존했습니다.
핵 추출을 사용하여 얻은 데이터로부터 고품질 메트릭이 관찰되었습니다. 균일한 매니폴드 근사 및 투영은 모든 핵 및 주요 세포 유형에 걸친 카운트 수를 나타내며, 이는 핵 전사체 및 상대적으로 얕은 시퀀싱으로만 확실하게 식별할 수 있습니다. 이 접근법은 간 특이 적 전사 인자 및 생체 이물질의 대사에 관여하는 다운 스트림 표적 유전자의 조사를 허용했습니다.
중심성 CYP2E1 및 문맥 주위 CYP2F2와 같은 특징적인 유전자의 보완 패턴은 추출된 핵이 간 기증에 대한 중요한 정보를 보유하고 있음을 보여주었습니다. RNA의 유전자 발현 라이브러리는 핵 당 44, 600 판독의 깊이로, ATAC 라이브러리는 핵 당 43, 500 판독의 깊이로 시퀀싱되었다. Seurat 및 Signac 패키지를 사용하여 RNA와 ATAC 두 양식의 다중 측정을 위해 수행된 가중 최근접 이웃 분석을 통해 세포 크기 또는 핵 취약성으로 인한 현저한 편향 없이 주요 및 부 간 세포 유형을 식별하고 주석을 달 수 있었습니다.
상류 전사 조절제와 간 기증의 특징적인 유전자도이 방법에서 검출되었습니다. 유봉을 위아래로 움직일 때 다운의 균질화 과정에서 너무 많은 거품을 생성하지 않고 프로토콜에 표시된 스트로크 수를 고수하는 것이 중요합니다.
