Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

우리의 방법은 단일 세포 수준에서 복잡한 조직의 유전자 발현 데이터를 생성하고 이해하는 데 도움이 됩니다. 우리의 방법은 기본적으로 동일한 방식으로 모든 조직에 적용할 수 있으며 프로토콜 관련 아티팩트가 거의 없는 고품질 데이터로 이어집니다. Schmidt-Ott 연구실의 Janna Leiz 박사와 제가 프로토콜을 발표할 것입니다.

차가운 해부 판에 신장을 놓고 날카로운 메스 또는 면도날을 사용하여 1-2 밀리미터의 중간 조각을 얻습니다. 조직 조각에 전체 피질 수질 축이 포함되어 있는지 확인하십시오. 미세 해부 가위와 집게를 사용하여 중앙 부분의 측면에서 피질을 조심스럽게 다듬습니다.

해부된 조직 조각 내에서 피질, 외부 수질 및 내부 수질의 세 부분이 명확하게 보여야 합니다. 신장 조각을 미리 준비된 RNA 안정화 용액으로 옮기고 RNA 분해를 피하기 위해 섭씨 4도에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, RNA 안정화 용액을 제거한다.

티슈 페이퍼로 여분의 용액을 조심스럽게 제거하고 더 사용할 때까지 티슈를 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 냉동 신장 조각을 가져다가 1밀리리터의 핵 용해 완충액 1(NLB1)이 들어 있는 얼음 위의 60mm 사전 냉각 폴리스티렌 페트리 접시에 옮깁니다. 면도날이나 메스를 사용하여 티슈를 완전히 다집니다.

1밀리리터 피펫 팁의 끝을 잘라내고 다진 티슈와 버퍼를 얼음 위에 놓인 그라인더 튜브에 옮깁니다. 모든 조각이 옮겨 졌는지 확인하고 페트리 접시를 버퍼로 5-10 번 씻으십시오. 얼음 위의 그라인더 튜브에서 유봉 A를 위아래로 천천히 25회 움직여 현탁액을 균질화합니다.

얼음 위에서 미리 냉각된 15밀리리터 수집 튜브에서 100마이크로미터 스트레이너를 통해 균질액을 통과시키고 다른 1밀리리터의 NLB1로 필터를 세척합니다. 차가운 EZ 핵 용해 완충액으로 그라인더 튜브를 세척하고 완충액을 폐기합니다. 균질액을 그라인더 튜브로 다시 옮기고 얼음 위의 그라인더 튜브에서 유봉 B를 위아래로 천천히 15회 움직여 현탁액을 균질화합니다.

균질액을 얼음 위에서 미리 냉각된 15밀리리터 수집 튜브로 옮깁니다. 그라인더 튜브를 NLB1 2 밀리리터로 세척하고 모든 조직 조각을 수집 튜브로 옮깁니다. 균질액을 얼음 위에서 5분 동안 배양하여 세포를 용해시킵니다.

균질액을 40마이크로미터 스트레이너를 통해 미리 냉각된 15밀리리터 수집 튜브에 통과시킵니다. 스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기에서 섭씨 4도에서 500배 G로 5분 동안 수집 튜브를 돌립니다. 그 동안 RNase 억제제 용액을 NLB2에 추가합니다.

펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하십시오. NLB2 4 밀리리터에 펠렛을 조심스럽게 재현 탁하십시오. 1밀리리터의 자당 그라데이션 버퍼로 현탁액을 조심스럽게 밑받침합니다.

스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기에서 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 서스펜션을 돌립니다. 한편, RNase 억제제 용액을 핵 현탁액 완충액에 첨가한다. 원심분리 후 원심분리기에서 수집 튜브를 부드럽게 제거하고 수집 튜브를 취급할 때 두 층을 방해하지 않도록 주의하십시오.

세포 파편은 두 층 사이에서 관찰 될 수 있습니다. 파편부터 시작하여 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 핵 펠릿을 방해하지 않고 나머지 상층액을 제거하고 1밀리리터의 핵 현탁액 완충액에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.

균질액을 20마이크로미터 스트레이너를 통해 사전 냉각된 5밀리리터 형광 활성화 세포 분류 수집 튜브에 통과시킵니다. 유전자의 수는 분리된 핵의 품질을 평가하기 위해 고유한 분자 식별자에 의해 정의되고 미토콘드리아 판독의 분율에 의해 착색된 전사체의 수에 대해 플롯되었습니다. 총 20, 000 개의 유전자가 6, 000 개의 핵에서 검출되었으며, 핵 당 1, 600 개의 중간 유전자 및 2, 800 개의 중간 고유 분자 식별자가 있습니다.

클러스터-농축 마커의 유전자 발현 패턴은 도트 플롯 및 t-분포 확률적 이웃 임베딩 플롯에서 세포 유형 클러스터를 사용하여 시각화되었습니다. 각 세포 유형의 백분율을 계산하여 두꺼운 상행 사지 세포에 대한 근위 세뇨관의 비율을 결정하는 데 사용했습니다. 항상 섭씨 4도에서 작업하고 고품질 현탁액과 최적의 농도를 보장하기 위해 시험 실행에서 최적의 조직 양을 결정하는 것이 중요합니다.