단일 세포 또는 세포 유형에 대한 전사체 분석은 이질성에 의해 가려지는 유전자 발현의 미묘한 차이를 감지할 수 있으며, 이는 정교한 세포 내 조절 메커니즘을 밝히는 강력한 도구입니다. 형광 활성화 세포 분류 후 RN-seq 분석은 높은 전사체 검출 감도 및 다른 다중 오믹 접근법과의 호환성을 갖춘 단일 세포 또는 벌크 세포 유형 모드에서 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 처음 사용하는 사용자는 원형질체 분류 및 RNA-seq 라이브러리 준비의 일부 단계에 주의를 기울여야 합니다.
Jun Zhang과 함께 우리 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Rongrong Xie가 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다. 먼저 애기장대 야생형 및 형광 마커 라인 종자를 20% 표백제에 넣고 실온에서 회전 배양기를 사용하여 15분 동안 배양하여 종자를 살균합니다. 멸균 된 벤치에서 작업하는 동안 이중 증류수로 씨앗을 3-5 번 헹굽니다.
야생형 및 리포터 라인 종자를 부피 한천당 0.8% 중량으로 절반 강도 MS 배지에 플레이트합니다. 섭씨 4도에서 이틀 동안 식물을 층화하십시오. 그런 다음 섭씨 23도에서 5 일 동안 16 시간의 빛과 18 시간의 어둠주기로 수직으로 자랍니다.
실험 전에 용액 A와 용액 B라고 하는 원형질체 용액을 얼음 위에서 부드럽게 해동합니다. 깨끗한 칼날이나 가위를 사용하여 식물의 뿌리를 잘라 내고 뿌리를 약 0.5cm 조각으로 자릅니다. 잘게 잘린 뿌리를 1.5 밀리리터의 용액 B에 담그고 실온에서 1.5-2 시간 동안 부드럽게 회전시킨다.
생성 된 뿌리 원형질체를 40 미크론 스트레이너 메쉬를 통해 여과하고 1-2 밀리리터의 용액으로 메쉬를 헹굽니다. 피펫을 사용하여 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 500 내지 600 마이크로리터의 용액 A에 재현탁시키고, 즉시 얼음 위에 놓는다. 세포 분류를 위해 재현탁된 세포 용액을 새로운 5밀리리터 시험관으로 옮깁니다.
피복액 탱크를 채우고 폐기물 탱크를 확인하십시오. 그런 다음 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 기계를 켭니다. 분류기에서 기기 설정 및 자동 보정 단계를 수행합니다.
형광 채널을 선택하고 형광이 없는 야생형 식물을 기준선 대조군으로 사용합니다. 형광 강도와 전방 산란 및 측면 산란 싱글렛을 기반으로 분류 게이트를 조정합니다. 1.5 밀리리터 수집 튜브에 500 마이크로 리터의 용액 A를 첨가 한 후, 분류를 시작하고 튜브 당 2, 000에서 3, 000 세포를 수집하십시오.
분류 후 즉시 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 세포가 들어 있는 수집 튜브를 섭씨 300G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 피펫으로 상청액을 제거합니다. 2마이크로리터의 분류된 세포를 채취하여 형광 현미경을 사용하여 형광을 확인합니다.
즉시 사용하지 않을 경우 정렬된 셀을 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 단일 세포 인덱스 분류의 경우 멤브레인이 있는 96웰 플레이트를 어댑터에 넣습니다. 물방울이 판의 중앙 구멍에 떨어지도록 판의 위치를 보정하십시오.
96웰 플레이트에서 멤브레인을 제거하고 96웰 플레이트를 어댑터에 넣습니다. 정렬할 때 단일 셀 정렬 모드를 선택합니다. 정렬 된 셀의 목표 수를 1로 입력하고 정렬을 시작합니다.
실험을 시작하기 전에 표면 오염 제거제와 75% 에탄올로 벤치를 청소하십시오. 라이브러리 준비 시퀀싱을 위해서만 모든 장비를 사용하십시오. 새로 준비한 혼합물 A 1 마이크로 리터를 분류 된 샘플에 첨가 한 후 멸균 된 유봉으로 분쇄합니다.
RNAse free water를 사용하여 부피를 14 마이크로 리터로 구성하십시오. 그런 다음 각 샘플을 0.2밀리리터의 얇은 벽으로 된 PCR 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 혼합물 B를 준비합니다. 혼합물 B에 4.4 마이크로 리터를 샘플이 들어있는 각 PCR 튜브에 넣고 부드러운 피펫 팅으로 혼합합니다.
샘플을 섭씨 72도에서 3분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 즉시 샘플을 얼음 위에 올려 놓고 올리고 dT를 폴리A 테일에 혼성화시켰다. 역전사 반응 혼합물 또는 혼합물 C를 샘플을 함유하는 각 튜브에 21.6 마이크로리터로 준비한다.
역전사 프로그램에 따라 일반적인 PCR 장비에서 역전사 반응을 하는 샘플을 대상으로 합니다. 새로 제조된 사전 증폭 반응 혼합물 또는 혼합물 D 40.8 마이크로리터를 역전사 반응 생성물에 첨가하고 사전 증폭 프로그램을 실행합니다. 증폭 주기는 반응이 지수 단계에 접어들 때 정량적 PCR에 의해 결정될 수 있습니다.
사전 증폭 반응 생성물을 정제하기 위해, 사전 증폭된 생성물을 PCR 튜브에서 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 48마이크로리터의 AMPure XP 비드를 각 시료에 넣고 배양 전에 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 샘플과 비드가 들어 있는 1.5밀리리터 튜브를 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓습니다.
비드를 방해하지 않고 샘플에서 상청액을 조심스럽게 버리십시오. 200마이크로리터의 80% 에탄올에 다시 현탁한 후 자기 분리 스탠드에 3분 더 놓습니다. 에탄올 함유 상층액을 버린 후, 샘플을 튜브에서 10분 동안 자연 건조시킨다.
비드를 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓습니다. 피펫을 사용하여 각 튜브에서 18마이크로리터의 상층액을 새로운 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
마지막으로, 텍스트에 설명된 단계에 따라 사전 라이브러리를 특성화한 다음 라이브러리 구성, 정제 및 정량화를 수행합니다. 형광 Arabidopsis thaliana 마커 라인은 형광 단백질을 표적 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 유전자와 융합하거나 인핸서 트랩 라인을 사용하여 개발되었습니다. 형광 특이적으로 표시된 원형질체는 형광 강도와 전방 산란 및 측면 산란 단일항을 기반으로 성공적으로 분류되었습니다.
분류된 세포는 명시야 및 형광 이미징을 사용하여 시각화되었습니다. 약 2, 000개의 목부 극 주위 세포, 측근 원시 세포, 내피 또는 피질 세포, 및 측근 캡 세포의 RNA 시퀀싱 라이브러리의 대표적인 결과가 표시됩니다. 프라이머 또는 어댑터 이량체 피크가 있는 작은 크기의 라이브러리는 크기 선택 후에도 여전히 시퀀싱할 수 있습니다.
비정상적인 크기 분포를 가진 라이브러리는 라이브러리 준비가 실패했음을 나타냅니다. 유전자 발현 패턴을 분석하였다. 4가지 뿌리 세포 유형 중 하나에서 농축된 유전자를 클러스터링하고 다른 세포 유형 간의 유전자 발현의 특이성을 보여주는 히트 맵에 묘사했습니다.
정확한 게이팅 및 분류와 RNA 분해 방지를 통한 표적 세포의 높은 품질과 순도는 성공적인 라이브러리 구축의 핵심입니다. 단일 세포 모드의 RNA-seq의 경우, 고유 분자 식별자와 통합된 여러 방법이 최근에 보고되어 성능이 크게 향상되었습니다.
