이 프로토콜은 염색질 면역침전 실험을 위해 냉동 간 표본에서 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 염색질 추출을 가능하게 합니다. 시작하려면 얼어 붙은 조직이 들어있는 튜브를 모르타르에 넣고 5 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 더 이상 단단한 부스러기가 없을 때까지 미리 식힌 유봉을 사용하여 샘플에 압력을 가합니다.
모르타르에서 샘플이 들어있는 튜브를 제거합니다. 필요한 억제제와 함께 950마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하고 샘플이 완전히 재현탁될 때까지 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다. 조직 현탁액을 즉시 균질화기로 옮기고 유봉 A로 20-30 스트로크를 적용하여 더 미세한 현탁액을 얻습니다.
거품을 방지하기 위해 유봉을 액상 외부로 이동시키지 마십시오. 균질액을 이전에 얼음 위에서 식힌 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 1, 300G 및 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
상청액을 조심스럽게 제거하고 부드러운 피펫팅으로 펠릿을 950마이크로리터의 실온 PBS에 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 63.6 마이크로 리터의 16 % 메탄올이없는 포름 알데히드를 첨가하여 1 %의 최종 농도를 얻고 즉시 실온에서 10 분 동안 튜브를 회전시킵니다. 회전 후, 실온에서 1.25 몰 글리신 113 마이크로리터를 첨가하여 125 밀리몰 최종 농도를 얻고, 튜브를 5분 더 회전시킨다.
그런 다음 섭씨 4도에서 3 분 동안 1, 300 G에서 샘플을 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 필요한 억제제와 함께 950마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS에 피펫팅하여 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 샘플을 다시 원심분리하고 이전에 시연한 대로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
원심분리 단계를 한 번 더 반복하고 즉시 염색질 분리 절차를 진행합니다. 필요한 억제제와 함께 950마이크로리터의 버퍼 A를 펠릿에 추가하고 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브를 돌립니다.
회전 후, 섭씨 4도에서 5 분 동안 2, 000 G에서 샘플을 원심 분리하고 상청액을 조심스럽게 제거한다. 필요한 억제제와 함께 버퍼 B 950마이크로리터를 펠릿에 추가하고 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브를 돌립니다.
회전 후 샘플을 다시 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다. 그런 다음 필요한 억제제와 함께 300 마이크로 리터의 실온 버퍼 C를 펠릿에 넣고 피펫을 세게 피펫합니다.
샘플을 15-30초 동안 소용돌이칩니다. 그런 다음 튜브를 짧게 돌려 뚜껑에 방울을 모으십시오. 염색질 샘플을 초음파 처리 한 후 30 마이크로 리터의 10 % Triton X-100 용액을 넣고 5-10 초 동안 소용돌이칩니다.
섭씨 4도에서 15 분 동안 16, 000 G에서 샘플을 원심 분리합니다. 그리고 상청액을 얼음 위에서 미리 냉각된 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 10 내지 25 마이크로리터의 전단된 염색질을 새로운 튜브로 옮기고, 완충액 C를 첨가하여 200 마이크로리터의 최종 부피에 도달한다.
분취량과 충격은 추가 사용이 있을 때까지 나머지 염색질을 섭씨 영하 80도에서 동결시킵니다. 5 몰 염화나트륨 8 마이크로 리터를 첨가하고 1, 000 RPM에서 진탕하면서 가열 블록에서 섭씨 65도에서 최소 6 시간 동안 배양한다. 가능하면 배양을 밤새 연장하십시오.
샘플을 실온에서 5 분 동안 식힌 후, 2 마이크로 리터의 RNase A를 첨가하고 1, 000 RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양한다. 가열 블록에서 샘플을 제거하고 300 밀리몰 염화칼슘 7 마이크로 리터와 2 마이크로 리터의 단백질 분해 효소 K.Incubate 1, 000 RPM에서 흔들면서 섭씨 56도에서 30 분 동안 가열 블록에서 샘플을 배양합니다. 한편, 섭씨 4도에서 1 분 동안 16, 000 G까지 원심 분리하여 모든 샘플에 대해 하나의 상 분리 튜브를 준비하십시오.
가열 블록에서 튜브를 제거하고 실온에서 3분 동안 평형을 유지한 후 400마이크로리터의 샘플을 이전에 원심분리된 상분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 400 마이크로 리터의 페놀 클로로포름 이소 아밀 알코올 용액을 첨가하고 5 초 동안 와동시킨다. 튜브를 섭씨 4도에서 5 분 동안 16, 000 G에서 원심 분리합니다.
그런 다음 400 마이크로 리터의 클로로포름과 와류를 5 초 동안 첨가하십시오. 튜브를 5 분 더 원심 분리하고 상부 상 400 마이크로 리터를 5 몰 염화나트륨 24 마이크로 리터와 글리코겐 0.75 마이크로 리터가 들어있는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 잠시 소용돌이칩니다.
1, 055 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 그런 다음 샘플을 완전히 소용돌이 치고 섭씨 영하 80도에서 1 시간 동안 또는 섭씨 영하 20도에서 밤새 배양합니다. 배양이 완료된 후, 섭씨 4도에서 30 분 동안 16, 000 G에서 샘플을 원심 분리하고 펠렛을 탈구시키지 않고 상청액을 조심스럽게 제거한다.
차가운 500 % 에탄올 70 마이크로 리터를 넣고 튜브를 부드럽게 기울여 펠릿이 씻겨 지도록합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 15 분 동안 16, 000 G에서 원심 분리합니다. 전체 상청액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 실온에서 건조시킵니다.
또는 더 빠른 건조를 위해 튜브를 섭씨 37도에서 배양합니다. 50 마이크로 리터의 Tris-EDTA 용액을 첨가하고 300 RPM에서 진탕하에 5 내지 10 분 동안 가열 블록에 튜브를 놓는다. 그런 다음 1 % 아가로스 젤에서 DNA를 분석합니다.
염색질의 탈가교 결합 및 아가로스 겔 상의 DNA의 시각화 후, 성공적인 전단은 100 내지 300 염기쌍 범위의 단편의 존재에 의해 인식될 수 있다. 염색질은 H3K4 트리메틸화, H3K27 아세틸화 및 H3 K27 트리메틸화 항체로 성공적으로 침전되었고 qPCR에 의해 추가로 분석되었습니다. 염색체 1 개방 판독 프레임 43, 프로테아좀 20S 서브유닛 베타 2, 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 프로모터 영역은 간에서 활발하게 전사되어 H3K4 트리메틸화 및 H3K27 아세틸화에 대한 농축을 나타냈다.
비교해 보면, 호메오박스 C13, 호메오박스 C12 및 마우스 미엘린 전사인자 1 프로모터 간에서 침묵하는 영역은 예상대로 풍부하지 않았다. H3 K27 트리메틸화는 반대 거동을 나타내어 염색질 면역침전 또는 ChIP 분석의 성공을 확인합니다. 염색질은 ChIP-Seq에 성공적으로 노출되었습니다.
시퀀싱 후, 갈대는 미리 준비된 인덱스에 정렬되고 종에 따라 분리되었습니다. 유전자 전사 시작 부위에서의 H3K4 트리메틸화 및 H3K27 아세틸화 침착은 예상대로 H3K27 트리메틸화 증착과 길항된다. Hox C 클러스터는 마우스와 인간 간 모두에서 전사적으로 비활성인 것으로 알려져 있습니다.
H3K4 트리메틸화 및 H3K27 아세틸화의 프로파일링은 클러스터 외부에서 이 두 가지 번역 후 변형에 대한 피크를 보여주는 반면, H3K27 트리메틸화의 신호 강도는 유전자 클러스터 내에서 증가하는 경향이 있습니다. 냉동 조직 표본에서 염색질 추출은 가교 중 세포 현탁액의 미세도와 온도에 크게 의존하는 높은 고유 가변성을 가지고 있습니다. 고정된 실험실 조건을 보장하면 절편 크기 범위 재현성을 유지하는 데 도움이 됩니다.
