저자는 매사 추세츠 의과 대학의 대학에서 유동세포계측법 핵심 시설에서 박사 리차드 Konz 직원에서 제공하는 조언 및 기술 지원을 주셔서 감사합니다. 당뇨병 내분비학 연구 센터 부여 DK032520 지원의 핵심 자원도 사용되었습니다. 이 작품은 정신 건강의 국립 연구소 (NIMH), 약물 남용의 국립 연구소 (니다) 및 아동 보건 인간 발달의 국립 연구소에서 기금에 의해 지원됩니다.

핵 추출 <ol><li> douncer 5 ML의 용해 버퍼 1 냉동 사후 뇌 조직 250 MG를 넣어 얼음에 놓으십시오. 정렬 외과 이후 만 5 핵을 받게하기 위해, 우리는 일반적으로 샘플 당 조직 1000 MG를 사용합니다. </li><li> 조직은 해동되면, 동안 얼음에서 1 분 조직을 다운스. </li><li> 균질 조직을 가지고 15 ML 맑은 초원 심 분리기 튜브에 넣습니다. 얼음에 튜브를 넣어. </li><li> , 피펫과 자당 솔루션이 9 ML을 가지고 명확한 초원 심 분리기 튜브의 하단에있는 피펫을 놓고, 자당 솔루션 2 위에 균질 조직 솔루션 농도 기울기를 만들 자당 솔루션 2 릴리스. </li><li> 초원 심 분리기 내에서 회전하는 동안 그들이 모두 균형 수 있는지 확인하기 위해 초원 심 분리기 튜브의 무게를. 상단 레이어에 용해 완충액 1 추가하여 중량 어떤 조정합니다. </li><li> 튜브가 아무리 발버둥치고 후 회전자의 버킷으로 그들을 놓으십시오. </li><li> SW28 회전자에 모든 양동이를 놓고 조심스럽게 초원 심 분리기에 날개를 놓으십시오. </li><li> 4 2.5 시간 107163.6 RCF에서 샘플을 초원 심 분리기 ° C. </li><li> 원심 분리가 완료되면 튜브의 하단에있는 핵을 포함하는 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 진공의 사용과 함께, 농도 기울기에서 발견된 파편의 계층과 함께 뜨는을 제거합니다. </li><li> 각각의 펠렛에 1X PBS 500 μL를 추가하고 20 분 동안 얼음에 앉아 보자. 이것은 펠릿가 쉽게 나중에 기계적 스트레스의 양을 핵 경험을 lessens하는, 그리고 아래로 pipetting하여 해산 수 있도록 자체에 약간 용해 수 있습니다. </li><li> 핵 20 분 동안 얼음에 incubated 후, 기계적으로 완전히 1XPBS 이내에 핵을 해산하기 위해 아래 피펫합니다. </li><li> 초원 심 분리기 튜브의 핵 함유 솔루션을 제거하고 하나 둘 ML의 microcentrifuge 관 두개의 튜브의 내용을 결합하여. 다시 얼음 샘플을 넣으십시오. </li></ol> 외과에 대한 Immunostaining <ol><li> 이 시점에서, 기본 및 보조 항체로 구성된 immunostaining 혼합을하고, 믹스를 차단. 각 예제, NeuN 항체, 0.5 % BSA와 10 % 정상 염소 1XPBS에 세럼, 그리고 알렉사 플루어 488 1 μL를 포함 차단 믹스, 100 μL의 1.2 μL를 포함 1XPBS 300 μL을 결합. 컨트롤 샘플, 기본 NeuN 항체를 제외하고, 대신, 더 많은 1XPBS를 추가합니다. </li><li> 소용돌이 어둠 속에서 실온에서 5 분 immunostaining 혼합물과 부화. </li><li> 얼룩 혼합물은 잠복기지만, 샘플 컨트롤을합니다. 혼자 핵을 포함, 샘플을 정렬 외과 들어, &quot;흠없는 컨트롤이&quot;필요라는, 두 번째 샘플, 부정적인 컨트롤을 기본 항체 NeuN도 필요없이 이차 항체 알렉사 플루어 488로 핵을 포함하는. </li><li> 부정적인 제어를위한 1XPBS의 980 UL을 포함하는 다른 두 ML 튜브에 흠없는 컨트롤에 대한 1XPBS, 다른 20 μL를 포함하는 2 ML의 microcentrifuge 관에 솔루션을 포함하고있는 핵의 나누어지는 20 μL. 의 볼륨 핵 함유 1XPBS 1 ML까지 다시 샘플을 올립니다. 모든 샘플은 얼음에 다시 배치됩니다. </li><li> immunostaining 혼합물은 잠복기 완료 했으니, 해당 샘플에 401 μL의 내용을 추가합니다. 부정적인 예제는 보조 항체 알렉사 플루어 488를 포함하는 혼합물을 받게됩니다 동안 핵의 샘플은, NeuN과 알렉사 플루어 488 모두를 포함하는 혼합물을 받게됩니다. </li><li> 45 분 동안 어둠 속에서 회전하는 차가운 방으로 샘플을 가져가라. </li><li> 샘플 45 분 동안 어둠 속에서 incubated 후, 얼음에 넣고 외과 시설에 그들을 데리고. 외과 시설에 전송하는 동안, 샘플은 얼음과 어둠에 보관해야합니다. </li></ol> 외과 <ol><li> 외과의 시설에서, 40 음 필터를 통해 샘플을 필터링합니다. 감기에 보관하면서 다음, 정렬 전에 예비 데이터를 얻기 위해서, 몇 분 동안 악기를 통해 그들을 실행합니다. </li><li> 이 시점에서, 그것은 정렬에 필요한 적절한 성문을 설정할 필요가 있습니다. 몇 가지 다른 종류의 게이트는 샘플하는 데 사용됩니다. 첫 번째 게이트는 샘플 내에서 발견된 다른 핵의 크기의 아이디어를 제공하고, 실제 핵의 파편 separatation 수 있습니다. 두 번째 게이트는 우리가 개별적으로 핵을 정렬할 수 있습니다. 폐기 모든 집합체는이 시점에서 무시됩니다. 마지막으로, 세 번째 게이트는 우리의 차 항체에있는 fluorochrome의 일치, 특정 형광 파장으로 설정됩니다. 이 게이트를 게재하면 우리 정렬할 수 있으며 따라서 별도의 NeuN의 +, NeuN부터의 연결을 핵 - 핵. </li><li> 모든 게이트가 선택되면 핵은 1XPBS으로 정렬할 수 있습니다. </li><li> 일단전체 예제를 통해 간, 악기를 통해 정렬 샘플의 나누어지는을 실행하여 일종의 순도를 확인하십시오. 샘플의 형광이 펼쳐 아니지만, 오히려 하나의 사분면에 포함된 있는지 확인합니다. 90 % 이상 순수 아르 샘플을 선택하는 것이 좋습니다. </li></ol> 외과 후 <ol><li> 일단 샘플이 시작할 수 있습니다 핵 처리 정렬되었습니다. 정렬 샘플 10 ML을 가지고 그것에 자당 솔루션 2, 1M CaCl 2 50 UL과 1m MG (에이스) 2 30 UL 2 ML를 추가합니다. 거듭 말씀 드리지만, 항상 핵이 수정되지 않은 있기 때문에 얼음에 샘플을 보관해야합니다. </li><li> 정렬 샘플 미만 10 ML가있다면, 1XPBS을 추가로 10 ML에 볼륨을 높이거나 적절하게 추가 자료를 조정합니다. </li><li> 15 분 샘플에게 얼음에 몇 시간과 장소를 반전. </li><li> 샘플은 15 분 동안 얼음에 incubated 후, 4에서 15 분 동안 1,786 RCF에서 스윙 버켓 로터에서 그들을 원심 분리기 ° C. </li><li> 튜브의 하단에있는 흰색 펠렛 방해하지 않고, 진공의 사용으로 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 당신이 진행 실험에 필요한 어떤 솔루션을 200 μl의 펠렛을 디졸브, 그리고 위아래로 피펫합니다. </li><li> 작은 튜브에 솔루션을 전송하여 추가로 사용할 때까지 -80 ° C 냉장고에 넣습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

여기에 제시 프로토콜이 더 일반적으로 epigenetic의 연결을 염색질의 변화와에 초점을 맞춘 연구에 특히 유용해야 정상적인 개발과 노화, 또는 신경 또는 정신 질환 중의 연결을 핵의 분자 표현형에. 잠재적인 노화의 과정에서 신경 세포 - 투 - glia의 배급에있는 교대 또는 질병에 의한 포함한 뇌 조직의 세포 이질이 우려 일아르 때 방법은 특히 장점입니다. 예를 들어, 염색질의 immunoprecipitation 기술과 함께 현재 정렬 프로토콜을 결합하여, 우리는 최근에 neurotrophic 요인 (BDNF) 유전자 프로 모터를 파생 두뇌에 신경 세포 특정 히스톤 methylation 패턴을 설명하고, 추가의 연결을 유전자 2. 유사한 방법을 회고 출산 데이트 3 성인 대뇌 피질의 뉴런를 수집하기 위해 이전에 사용했다. 정렬 기술은 또한 마우스 뇌 2 고용 때문에의 핵의 안정성의 냉동 당시 해동 조직을, 우리가 여기에서 제시한 접근 방식이 인류의 다양한 적용됩니다 것을 기대하고 있습니다.했습니다 에 관해서는 조금 만 같은 세포에서 염색질 immunoprecipitation 이제 훨씬 더 포괄적인 게놈 범위 4 가능하기 때문에, 우리가 위의 권장되는 자료를 시작하는 1000 MG보다 훨씬 적게 사용할 수 있습니다.

시약 : <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. 용해 완충액 </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> 자당 </td><td> 5.47 g </td></tr><tr><td> 5 MM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 μl </td></tr><tr><td> 3 MM </td><td> MG (아세테이트) 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> 0.1 MM </td><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> 트리스 - HCL, pH8 </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> 1 ㎜ </td><td> DTT </td><td> 17 μl </td></tr><tr><td> 0.1 % </td><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Autoclaved 물로 50 ML에 볼륨을 조정 </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. 자당 솔루션 </th></tr><tr><td> 1.8 M </td><td> 자당 </td><td> 30.78 g </td></tr><tr><td> 3 MM </td><td> MG (아세테이트) 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> 1 ㎜ </td><td> DTT </td><td> 17 μl </td></tr><tr><td> 10 MM </td><td> 트리스 - HCL, pH8 </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Autoclaved 물로 50 ML에 볼륨을 조정 </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. 버퍼 다운스 </th></tr><tr><td> 10 MM </td><td> 트리스 </td><td> 0.242 g </td></tr><tr><td> 4 MM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0.163 g </td></tr><tr><td> 1 ㎜ </td><td> CaCl 2 </td><td> 0.03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Autoclaved 물 200 ML로 산도 7.5과 볼륨을 조정 </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

인간 두뇌의 뉴런은 태아 발달 동안 주로 postmitotic되며, 따라서 전체 수명에 걸쳐 그들의 핵을 유지합니다. 그러나, 약간은 개발과 노화 과정 동안의 연결 염색질과 핵 조직의 변화 또는 만성 neuropsychiatric 질병에 대해 잘 알려져 있습니다. 그러나, 대부분의 염색질과 DNA 기반 assays (물고기 이외의) 부족 단세포 해상도를 날짜합니다. 뉴런의 일반적으로 다양한 subpopulations가 glia 및 기타 비의 연결을 세포의 다른 종류의 혼합된 있기 때문에이를 위해, 뇌 조직의 상당한 이질 세포는 상당한 한계를 포즈. 한 가지 가능한 솔루션은 셀 타입의 특정 문화를 성장하는 것이지만, 신경을 포함하여 대부분의 CNS의 세포는, 몇 주 동안, 최고의, 지속 전직 생체내이며, 따라서 잠재적으로 전체 수명에 걸쳐 운영 epigenetic 메커니즘에 대한 불완전한 모델을 제공하는 . 여기, 우리는 냉동 (고정 절대) 인간의 사후 두뇌에서 핵을 추출하고 정화하는 프로토콜을 제공합니다. 방법은 안티 NeuN 항체와 ultracentrifugation 및 immunotagging 다음 hypotonic 용해 버퍼에서 핵의 추출을 포함합니다. 라벨의 연결 핵은 다음 형광 활성화 정렬을 사용하여 별도로 수집하고 있습니다. 이 방법은 인류의 다양한에서 뇌 영역에 적용 및 사이트 및 수정 - 특정 안티 - 히스톤 항체 및 DNA의 methylation과 다른 assays를위한과 염색질의 immunoprecipitation 연구에 적합해야합니다.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

뇌 조직의 세포 이질은 대부분의 assays 단일 셀 해상도 부족하기 때문에 염색질의 epigenetic 자국의 연구에 대한 중요한 제한 포즈. 뉴런은 일반적으로 glia 및 기타 비의 연결을 세포와 혼합된 있습니다. 우리는 인간의 두뇌에서 핵의 연결을 추출하고 수집하는 프로토콜을 제공합니다.

인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K 조회수.  University of Massachusetts Medical School. 뇌 조직의 세포 이질은 대부분의 assays 단일 셀 해상도 부족하기 때문에 염색질의 epigenetic 자국의 연구에 대한 중요한 제한 포즈. 뉴런은 일반적으로 glia 및 기타 비의 연결을 세포와 혼합된 있습니다. 우리는 인간의 두뇌에서 핵의 연결을 추출하고 수집하는 프로토콜을 제공합니다.

비디오: Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

연구

생물학

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

인간의 사후 뇌 조직에서 단세포 집단의 고품질 RNA 구하기

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy homeostasis and the metabolism of xenobiotics, among others. These tasks are performed through tight coordination between hepatic parenchymal and non-parenchymal cells. Additionally, various metabolic activities are confined to specific areas of the hepatic lobule-a phenomenon called liver zonation. Recent advances in single-cell sequencing technologies have empowered researchers to investigate tissue heterogeneity at a single-cell resolution. In many complex tissues, including the liver, harsh enzymatic and/or mechanical dissociation protocols can negatively affect the viability or the quality of the single-cell suspensions needed to comprehensively characterize this organ in health and disease.
This paper describes a robust and reproducible protocol for isolating nuclei from frozen, archived liver tissues. This method yields high-quality nuclei that are compatible with downstream, single-cell omics approaches, including single-nucleus RNA-seq, assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq), as well as multimodal omics (joint RNA-seq and ATAC-seq). This method has been successfully used for the isolation of nuclei from healthy and diseased human, mouse, and non-human primate frozen liver samples. This approach allows the unbiased isolation of all the major cell types in the liver and, therefore, offers a robust methodology for studying the liver at the single-cell resolution.

Here, we present a protocol for isolating nuclei from flash-frozen, archived liver tissues for single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq, and joint multiomics (RNA-seq and ATAC-seq).

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Isolation and Profiling of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues(냉동 포유류 조직에서 단일 핵의 분리 및 프로파일링)

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

저자 스포트라이트: Enhancing Drug Discovery - Development of Automated, Standardized Protocols for Nuclei Extraction from Frozen Tissues(신약 개발 강화 - 동결 조직에서 핵 추출을 위한 자동화되고 표준화된 프로토콜 개발) 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.