이 연구는 NIH 보조금 (PN2EY016525 및 P41GM103832)에 의해 지원되었다. SHS는 걸프 지역 컨소시엄 (NIH 그랜트 번호 T32EB009379)의 학제 간 생명 과학 교육에 대한 WM 켁 센터에 NanoBiology 학제 간 대학원 교육 프로그램의 화목에 의해 지원되었다. SHS는 해부 성장하고 DRG와 해마 세포를 유리화, cryo 종 및 DRG와 해마 축삭의 크라이 ET 데이터를 수집, 재구성 및 틸트 시리즈 색상 주석. MRG는 해부와 MNR의 실험실에서 해마의 세포를 제공했다. SC는 경사 시리즈 주석의 지원. SHS는 뉴런을 해부하고 성장하는 방법에 대한 CW에 의해 훈련되었다. SHS, WCM, 화장실은 실험을 고안. SHS는 다른 저자의 의견으로 원고를 준비했다. 이 비디오는 t의 Biozentrum의 세포 이미징 및 NanoAnalytics (C-CINA)를위한 센터에서 촬영되었다대학 바젤 그. C-CINA는 스위스 바젤에있는 ETH 취리히의 바이오 시스템 공학 (D-BSSE)의 부서에 통합되어 있습니다.

1. 도금 차 뉴런을위한 EM 그리드와 요리 준비 <ol><li> 적어도 25 배의 배율로 광학 현미경을 사용하여 금 EM 그리드에 구멍 투성이의 탄소의 무결성을 검사합니다. 확인 탄소 구멍은&gt; 98 % 그대로 유지되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 기본 뉴런 도금의 경우, EM 격자를 화염 살균 동시에 그 친수성 ​​렌더링하는 분젠 버너를 사용합니다. 가장자리가 아닌 중앙 그리드 화 면적으로 EM 그리드를 데리러 핀셋을 사용합니다. 주의 : 자동 조명 분젠 버너를 두지 마십시오, 이러한 단계를 수행하는 동안 플라스틱 부품에 장갑이나 핀셋을 사용하지 마십시오 : <ol><li> 분젠 버너를 점화하기 전에 최소한의 개방 위치에 공기 및 가스 조정을 설정합니다. </li><li> 스트라이커 부싯돌 또는 부탄 라이터를 사용하여 분젠 버너에 불을. </li><li> 키도 크고, 밝은 블루 / 바이올렛 불꽃 내 작은 파란색 내부 불꽃을 달성하기 위해 공기 및 가스 조정을 수정합니다. 내부 불꽃의 끝이 불꽃의 가장 뜨거운 부분입니다. 아래의 손잡이버너의 총신이 공기가 버너 들어가는 양을 조절하기 위해 설정 될 수있는 반면 니스 버너, 가스 버너 튜브들이의 양을 조절한다. 공기 조절 시계 방향으로 돌리면 (보라색 불꽃의 결과로) 공기를 감소하고 반 시계 방향 (노란색 불꽃이 발생) 공기를 증가시킨다. </li><li> 탄소면이 위로 향하도록 두 번 불꽃을 통해 신속하게 전달, EM 그리드를 개최 금속 핀셋 (아무 플라스틱 부품)를 사용. 탄소 측 무광택 (이하 반짝)를 표시하고, 다른 쪽보다 칙칙한 색조의 더 많은 것을 가진 것입니다. </li><li> 즉시 분젠 버너의 10cm 이내에 배치 된 유리 바닥 접시의 중심으로 그리드 (탄소 쪽까지)를 전송합니다. 접시 당 하나의 EM 그리드 (그림 1)를 사용합니다. 만 presterilized하는 유리 바닥 요리, 즉 통해 감마 방사선을 사용합니다. </li></ol></li><li> 여전히 유리 BOTT 내부의 EM 그리드를 유지하는 동안 그리드 무결성 (탄소 구멍 그대로)을 확인하기 위해 광학 현미경을 사용하여OM 접시 (오염을 방지하기 위해). 신경과 접촉 할 그리드 또는 아무것도에 어떤 물질을 적용 할 때, 멸균 절차 및 멸균 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 멸균 절차를 사용하여 조직 문화 후드에서, 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 차분히 적절한 코팅 물질의 250 μl를 적용합니다. 적절한 코팅 물질이 전체 EM 그리드를 포함해야합니다. <ol><li> 해마의 신경 세포의 경우, 이전에 19 바와 같이 제조 코팅 물질로서 폴리-L-라이신 (PLL, 1 ㎎ / ㎖)을 사용한다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. 후근 신경절 (DRG) 뉴런의 경우, 다음과 같이 준비, 코팅 물질로 (재료 및 시약의 표 참조) Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 젤라틴 단백질 혼합물을 사용합니다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. <ol><li> 주식 병을 녹여4 ℃에서 하룻밤 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물의 </li><li> 차가운 유지 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포 및 얼음에 그들을 유지하여 즉, 솔루션을 만드는 데 사용되는 모든 구성 요소에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물. </li><li> 얼음, 1:20 희석액을 수득 Neurobasal 배지에서 젤라틴이 단백질 혼합물을 희석하면서 (즉 Neurobasal 10 ㎖에 젤라틴 단백질 혼합물의 500 μL 희석). </li><li> 나누기는 1 ㎖ 분량 씩에 젤라틴 단백질 혼합물을 희석하고, 즉시 -20 ℃ 여분의 분량 씩 저장 </li><li> 1.4 절에 설명 된대로, 접시 당, EM 그리드 당 250 μl를 적용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 상단에 페트리 접시를 덮고 (해마 시편 하나 PLL과 함께, 또는 DRG 표본의 젤라틴 단백질 혼합물) 배양 조직 문화 후드에서 실온에서 1 시간 동안. </li><li> ASPI(해마 표본에 대한) 모든 PLL 또는 요리에서 (DRG 시편) 젤라틴 단백질 혼합물을 평가. 이를 위해, 조직 배양 후드에서 진공 시스템을 사용한다. 진공 튜브에 부착 된 멸균 피펫 팁을 사용합니다. EM 그리드와의 직접적인 접촉을 피하십시오. </li><li> 주의 깊게 EM 그리드가 완전히 PBS에 포함되도록 각 페트리 접시의 중앙 유리 지역에 EM 그리드에 멸균 PBS (인산염 완충 식염수)의 250 μl를 적용하는 조정 가능한 공기 변위 피펫을 사용합니다. 그런 다음 각 접시에서 PBS를 대기음. 3 회 반복합니다. </li><li> EM 그리드와 함께 요리를 15 분의 조직 문화 후드에서 건조하도록 허용합니다. 그들은 조직 문화 방에있는 광학 현미경으로 검사하여 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. 반드시 그리드의 수분 기포가 없는지 확인합니다. 이 경우,주의 깊게 대기음 다음 EM 그리드에이 여분의 수분을 제거한다. 코팅 된 그리드는 신경을 도금 즉시 사용되어야한다. </li></ol> 2. 준비 및 PLEM 그리드에 ating 차 뉴런 <ol><li> 이전 19 설명한 바와 같이, 각각의 세포에 해마 (또는 18 일 된 쥐 배아의 후근 신경절을) 해리 기본 뉴런, 첫 해부를 Trypsinize (2.5 % 트립신을 사용하여) 씹다를 판에. <ol><li> 씹다 특히 화재 연마 팁 유리 피펫을 사용하여, 각각의 세포로 세포의 해리 덩어리를 설명하는 신경 생물 학자에 의해 사용되는 일반적인 용어입니다. 결과는 조심스럽게 천천히 피펫을 (~ 30), 상하, 여러 번 세포를 그리기 및 방출에 의해 달성된다. </li></ol></li><li> 마우스에 대한 더 적합한 제안 효소 (파파인, 콜라게나 / 디스 파제)를 사용하는 대신, 쥐 DRG 뉴런을 분리 (HBSS에) 0.25 % 트립신을 사용하여 메모를 복용 등의 이전에 DRG의 해부 및 세포 분리 (24)에 대해 설명한 절차에 따라 DRG 뉴런. </li><li> (즉 혈구를 사용하여) 절연 뉴런의 수를 계산및 접시 당 50000 세포 / ml의 농도를 달성하기 위해 각 접시에 적용하는 세포의 적절한 부피를 계산하기 위해이 값을 사용한다. 적용 할 수있는 최대 볼륨이 250 μL이다. 이것은 단지 중앙 유리 영역 전체가 아니라 요리를 채우는 것에주의. </li><li> 37 ℃의 CO 2 배양기에서 30 분 동안 접시를 품어 세포를 복구하고 준수 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 EM 그리드 방해가되지 않게주의하면서 각각의 요리에 가온 미디어 1.5 ML를 추가합니다. 미디어 유형은 세포 분류 (해마 또는 DRG)에 의존한다. <ol><li> 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 예열하는 해마의 신경 세포 19 또는 지느러미 루트 신경절 신경 세포 (24), 중 하나에 해당하는 매체를 준비합니다. CO 2 배양기에서 하룻밤 요리를 품어. </li><li> 해마 신경 세포의 경우, 다음날 미디어를 변경합니다. 14 일 동안 이틀 이후 미디어의 절반을 변경합니다. 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 미디어를 따뜻하게. </리&gt; <li> DRG 뉴런의 경우, 해부 / 도금 다음 날, 항 유사 분열 제 (우리 딘 5&#39; - 플루오로-2&#39;-데 옥시 우리 딘) 개별적으로, 각각 10 mM의 원액을 가진 매체의 신선한 재고를 준비, 최종를 사용 각각 10 μM의 농도. DRG 미디어 (875 μL)의 절반을 제거하고 항 유사 분열 제와 신선한 매체 875 μl를 추가합니다. <ol><li> DRG 뉴런를 들어, 첫 번째 주에 대한 매 2 일, 다른 항 유사 분열 미디어 및 표준 DRG 미디어 사이에 미디어를 변경. 둘째 주 들어 이틀 표준 DRG 미디어를 변경합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. EM 그리드에 신경을 유리화 <ol><li> 극저온에서 금메달 EM 그리드 냉동 및 저장 장비와 모든 재료를 준비 습도 챔버 (17)와 유리화 장치, 액체 질소의 유리화 기계, 긴 평탄 점 핀셋, 듀어 (들)에 대한 좋은 점 전문 핀셋 (LN 2), Coolant 용기, EM 그리드 스토리지 박스, 칼슘 무료 필터 종이. </li><li> 유리화 장치를 시작합니다. 32 ° C.에 100 % 및 온도에 습도를 설정 &quot;콘솔&quot;섹션에서 0 초로에 오점 시간을 설정합니다. 이 유리화 기계의 습도 챔버의 사이드 창을 통해 블로 팅 매뉴얼을 할 수 있습니다. </li><li> 세 논문이 누적되는 등을 레이어드, 장갑 칼슘 무료 필터 용지를 처리​​ 할 수​​ 있습니다. ~ 2cm 긴 0.5 cm 폭 스트립으로 스택을 잘라. 용지 한면이 × 0.5 cm의 얼굴 (그림 2) 0.5 cm가되도록 90 ° 각도를 구부린다. 핀셋을 사용하여, 중간 종이를 제거하고 사용할 때까지 다른 칼슘 무료 필터 종이에 놓습니다. </li><li> 유리화 챔버 내에서 버튼 홀더에 그리드 스토리지 버튼을 놓습니다. 액체 질소를 냉매 용기의 내부 챔버를 입력하고 완전한 증발 될 때까지 기다립니다. 일의 외부 챔버를 채우액체 질소와 E 냉매 용기는 다음 단계로 진행하기 위해 안정적인 온도를 달성 할 때까지. 냉각 된 챔버 내에서 액체 상태로 응축됩니다 고순도 가스 에탄과 내부 챔버를 입력합니다. </li><li> 바로 인근에 유리화 방에 수송을위한 대형 100mm 폴리스티렌 접시에 인큐베이터에서 접시 (들) 이동하지 않을 경우. 조심스럽게 접시에서 EM 그리드를 선택하는 전문 유리화 핀셋을 사용합니다. 뉴런은 EM 그리드에 성장하는 쪽면에, 위치는 다음 단계에 문제가됩니다. 안전하게 EM 그리드에 핀셋을 잠 핀셋 블랙 슬라이딩 잠금 장치를 사용합니다. </li><li> 유리화 기계 신경 세포가 떨어져 유리화 기계의 사이드 오픈 구멍에서 왼쪽으로 얼굴을 부착되어있는 EM 그리드 등 그 옆에 핀셋을 삽입합니다. 유리화 기계로 전문 족집게 후퇴. </li><li> 해당 홀더에 냉각수 용기를 올려유리화 기계. 그것은 적절한 LN 2와 액체 에탄으로 가득해야합니다. 이 습도 챔버의 하부로 플러시 될 때까지 유리화 기계의 적절한 화면 명령을 이용하여, 상향 냉각제 챔버를 올린다. </li><li> 평탄 점 핀셋, 짧은 쪽 (0.5 센티미터 × 0.5 cm 얼굴) 핀셋에 수직이되도록 필터 종이의 한쪽 끝을 잡고. 이 얼굴 (그림 2B)를 모래 바닥에 EM 그리드와 직접 접촉한다. 조심스럽게 유리화 기계의 습도 챔버의 측면 구멍 (그림 2A)에 종이 필터를 삽입합니다. 안정적으로 10 초 동안 (측면 멀리 표본에서 마주) EM 그리드에 대한 용지를 개최합니다. 이후 용지를 취소하고 즉시 유리화 기계의 자동화를 사용하여 액체 에탄의 표본을 뛰어 동결. </li><li> 조심스럽게 하나의 슬롯 중 하나에 냉동 - 수화 EM 그리드 전송그리드 스토리지 버튼. 요리의 추가 EM 그리드에 대해이 과정을 반복합니다. 이 실험에서 사용 된 EM 그리드 저장 버튼 체류 냉동 - 수화 EM 그리드를 저장할 수있다. </li></ol> 4. 이미지 수집, 처리, 및 주석 <ol><li> 2-D의 전자 현미경 사진 및 / 또는 저용량 조건 극저온 전자 현미경을 사용하여 신경 돌기의 3-D 틸트 시리즈 5를 수집 진행. 2-D 이미지는 3-D 틸트 시리즈 편리하게 얼음 두께 및 가능 영역의 관점에서 그리드의 품질을 평가하도록 하였다. <ol><li> 이 경우, 모든 이미지 / 12 μM 및 4.4의 샘플링 언더 포커스 대상에서 20K 현미경 배율에서 단일 경사 액체 질소 크라이 전사 홀더를 구비 한 200 kV의 전자 현미경에 부착 된 4K X 4K CCD 카메라를 사용하여 수집되었다 픽셀. </li><li> 증분 샘플​​ AL 틸팅 동안 샘플의 3 차원 단층 화상을 얻기 위해서는, 투영 이미지의 시리즈를 취할투과형 전자 현미경 (TEM)의 하나의 축 옹. 틸트 각도와 다른 실험 설정을 감안할 때, 자동으로 틸트 시리즈 5를 수집 사용할 수있는 여러 가지 다른 소프트웨어가있다. 여기에 표시된 3 차원 기울기 시리즈는 ~ 60 E / 2의 누적 복용량을 가진 5 ° 씩 60 ° -60 °의 범위에서 반자동 기울기 시리즈 수집 소프트웨어 (26)를 사용하여 동일한 현미경에 수집되었다. </li></ol></li><li> 앞서 다른 샘플 5,29 대해 기재된 화상 처리 소프트웨어 (21)를 사용하여 신경 돌기의 틸트 시리즈를 재구성. </li><li> 제 단층 화상을 분할하기 이전에 5 바와 같이 3-D 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 표면 모델을 작성하여 신경 돌기의 3-D 기능 색깔 주석. </li></ol>

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Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 쥐의 배아 신경 (척수 신경절 및 해마는) 골드 전자 현미경 (EM) 그리드에 성장 및 2-D cryo 종 및 3-D의 극저온을 사용하여 몇 군데되는 자신의 신경 돌기에 충분한 얇은 유리 같은 얼음에 고정 할 수 있다는 것을 보여 ET. 해마의 신경 돌기 이전 크라이 ET 8,10,18,23을 사용하여 몇 군데되었지만, 프로토콜이 부족 한 상업적으로 사용 가능한 장치를 사용하여 성공적으로 복제 충분히 상세?...

뉴런은 다운 스트림 신경과 의사 소통을하기위한 정보와 축삭, 종종 아주 긴을받을 모 수석을 정교화하여 중앙과 말초 신경계의 기능에 대한 복잡한 회로의 핵심을 설정합니다. 신경 돌기 가지 신경계의 비판적 기능을 지원 배아 발달과 신경 세포의 분화 및 신경 돌기의 유지 보수 동안 근본적인 역할을한다. Neuritic 과정은 신경 세포의 손상 및 재생뿐만 아니라, 신경계 장애에 비판적 있습니다. 신경 세포의 구조의 연구는 모두 정상 및 병에 걸린 뇌를 이해하는 것이 중요합니다. 다행히, 생리학 관련 신경 세포 배양 시스템은 복잡하고 이질적인 세포 구조를 요점을 되풀이 할 수있다. 고체 실험 플랫폼, 신경 세포의 형태의 정성 및 정량 분석​​을 가능하게 효과적인 시각화 전략의 해명에 따라 필요합니다. 특히 유용한 것나노 미터 스케일에서 신경 돌기, 축삭과 수상 돌기 모두를 시각화하기위한 일관성있는 플랫폼을 제공하는 자세한 방법합니다. 기존의 전자 현미경은 그들의 진정한 상태에서 시험편에 왜곡을 유도 할 수있는 탈수 수지 매립 중에 유기 용매의 사용을 필요로한다. 따라서 연구 결과 4,9,25의 해석을 제한 - 현재까지 나노 미터 스케일에서 가장 구조적 특성 분석은 이러한 가혹한 화학 물질에 노출되는 더 큰 세포 또는 조직을 기반으로합니다. 더욱이, 전자빔 침투, 절편은 1 내지 12 ㎛보다 큰 두께를 나타내는 생물체 또는 세포 돌기 요구된다. 마지막으로, 신경 돌기의 신장 기능의 성가신 정의하고, 개별 슬라이스 특정 데이터 세트의 컬렉션에 조직의 결과를 단면 또는 가공. 비록 극저온-EM위한 냉동 수화 시험편을 구획하는 것이 가능하는, 상기 방법은 압축 ARTIF 도입1 역할을합니다. 최근 몇 년 동안, 연구자들은 EM 그리드 및 플래시 동결 이후 크라이 ET 8,10,18,23를 사용하여 신경 돌기를 시각화하는 액체 에탄을 직접 해마의 신경 세포를 성장하는 방법을 배웠습니다. 그러나, 이러한 연구는 맞춤 장치 10,23, 또는 일상적인 시각화 (8, 18) 얇은만큼 유리 같은 얼음을 생성하는 모래 바닥 단계에 부족 세부 사항을 사용 하나. 예를 들어, 한 연구는 EM 그리드 (10)를 모래 바닥에 대한 30 ~ 40 초를 사용할 것을 권장하지만,이 값은 일반적으로 사용하지 최적화되어 있지만, 사용자 정의 - 만든 플 런지 냉동 장치에 대해 특정입니다. 플 런지 동결하는 샘플을 이전의 습도를 유지하기위한 사용자 정의 만든 장치가 아닌 시중에서 한 17를 사용하여 광범위한 재현성에 대한 장애물을 초래할 수 있습니다. 이 연구는 극저온 ET으로 신경 돌기를 시각화에 획기적인되었지만, 우리는 AP를 탐험 한 단계 더 촬영했습니다신경 세포의 표본 (해마와 후근 신경절 신경 세포)의 다양한 크라이 ET의 plicability. 또한, 우리는 최선과 차선의 결과뿐만 아니라, 하나는 시편 크라이 ET를 사용하여 발생할 수있는 잠재적 이슈를 모두 설명합니다. 네이티브에 가까운 상태로 보존하고 나노 미터 규모로 전체의 신경 돌기를 시각화에 대한 상세한 기술을 정의하는 것은 미세 구조 연구를 수행하기 위해 더 많은 연구에 대한 능력을 향상시킬 것입니다. 이를 위해, 우리는 신경 돌기를 시각화하는 정착, 흠 뉴런을 제조 시판 장비를 이용하여 효율적이고 상세한 프로토콜을 설명한다. 이것은 건강한 신경 돌기의 미세 구조를 자세히 설명하고 구조적 차이가 신경계 질병 모델에 존재하는 것을 이해하기위한 토대를 마련하기 위해 향한 중요한 첫 번째 단계입니다. CRYO-ET는 나노 미터 스케일에서 3-D에 고정되지 않은, 흠없는 신경 돌기의 기능을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 가능한 결코로하게 될 것입니다neuritic 건축 (12)를 정의하는 앞.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

신경 돌기, 모두 수상 돌기 및 축색 돌기는 뉴런 사이의 전기 자극의 전도를 가능하게 신경 세포 과정이다. 신경 돌기의 구조를 정의하는 것은 이러한 과정이 시냅스 통신을 지원 자료 및 신호를 이동하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 전자 현미경 (EM)는 전통적으로 신경 돌기 내의 미세 기능을 평가하는 데 사용되었습니다 있지만, 탈수 및 수지 매립시 유기 용제에 노출 구조를 왜곡 할 수 있습니다. 중요한 충족 목표는 유물의 영향을받지 구조 평가를 허용 절차의 수립이다. 여기, 우리는 성장하고 극저온 전자 단층 촬영 (크라이 ET)과의 시험 다음에 전자 현미경 그리드에 다른 차 신경의 플래시 냉동 전체의 신경 돌기에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설립했다. 이 기술은 ASSE 용이 나노 미터 분해능에서 냉동 수화 신경 돌기의 3-D 시각화를 허용자신의 형태 학적 차이 ssment. 우리의 프로토콜은 후근 신경절 (DRG) 신경 돌기, 그들의 네이티브에 가까운 상태에서 해마의 신경 돌기의 시각화의 전례가없는보기를 얻을 수 있습니다. 따라서,이 방법은 정상적인 신경 세포와 신경 장애에 의해 영향을 사람들 모두의 신경 돌기에 미래 연구를위한 기초를 만들 수 있습니다.

이전 크라이 ET를 통해 동결 및 이미징, 광학 현미경 이미지는 신경 세포가 성장하고있는 EM 그리드주의해야한다. 신경 돌기가 서로 상당한 중복하지 않고 명확하게 볼 수 있어야합니다. 그림 (a)에 색 상자가 확대 된에 신경 돌기가 격자의 격자에 걸쳐 확장되는 그림 (b)에서 높은 배율을 표시하는 영역을 나타냅니다. 각 그리드 사각형은 뉴런과 자신의 신경 돌기를 지원하...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K 조회수.  Baylor College of Medicine.  미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다. 

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

연구

신경과학

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

Compartmentalizing 기본 Murine 뉴런에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...