저자는이 프로토콜의 세련되고 년간 지원 NIH (DA19808와 O​​M에 DA15014)에 기여 이전 실험실 구성원 주셔서 감사합니다. 안나 ABT 1 &quot;neuroAIDS의 학제간 및 Translational 연구 교육&quot;(T32 - MH078795)의 동료이며 따라서이 작품은 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 5T32MH079785에 따라 국립 보건원에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. Glia의 해부 (~ 이주 도금 뉴런 전) <ol><li> 70 % 에탄올에 절개 장소 살균 도구를 준비하려면, (표 VI에서 수술 도구에 대한 자세한 내용을 볼 녹여 얼음 4 ML 차가운 해부 매체 60mm의 요리 (두뇌 당 한 접시), 장소 2.5 % 트립신과 DNase를 추가 ). </li><li> 100mm 살균 접시에 2-4일 오래된 새끼과 장소 헤드 목을 벨로 큰​​ 가위를 사용합니다. </li><li> 피부를 통해 중간선 인하를하고 두개골을 노출하기 위해 피부를 다시 끌어 중간 가위를 사용합니다. 뇌 조직 아래를 손상하지 않고, 중간선 잘라 두개골을 통해 두 측면 상처를 만들기 위해 곡선 가위를 사용합니다. 뇌를 노출 상단 두개골을 제거합니다. </li><li> 두뇌를 추출하고 (구성을 위해서 테이블을 참조) 4 ML 차가운 해부 매체를 포함하는 자체 60mm 접시에 넣습니다. stereomicroscope (Leica 줌 2000, 줌 제어 : 70-30)에서 접시를 놓고 반구를 분리하는 5 번 집게를 사용하여, midbrain을 제거하고 껍질 OFF meninges. </li><li> 차가운 해부 매체와 신선한 60mm 요리의 모든 해부 대뇌 cortices를 수집하고, 곡선 가위로 조직을 말하다. </li><li> 멸균 15 ML 튜브에 다진 조직을 전송합니다. 차가운 해부 매체와 4.5 ML에 볼륨을 준비하고 2.5 %의 트립신 500 μL를 추가합니다. Parafilm에 튜브를 싸서 역전 매 5 분 믹싱, 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 떠. (참고 : 여기서 우리가 최대 5 머리에 사용하는 경우에는 우리가 일반적으로 다음과 프로토콜을 설명, 더 많은 새끼를 사용하는 경우, 볼륨이 적절하게 조정해야 할 수도 있습니다) </li><li> 이월 트립신 함유 해부 매체의 볼륨을 최소화, 새로운 15 ML 튜브에 조직을 전송합니다. 신선한 해부 매체와 4.8mL에 볼륨을 가지고 60 ug / ML (재고 솔루션 : DNase 및 해부 매체 2 ML 5 MG MgSO4 3 MG)의 최종 농도에 도달 200 μL DNase를 추가합니다. 멸균 5 ML의 pipet과 함께 부드럽게 ~ 20 번 씹다테는 다음 (구성에 대한 테이블 II 참조) glia 도금 매체의 10 ML를 추가합니다. </li><li> 4~5분을 받아들여야 조직의 큰 조각을 허용 다음 50mL 튜브에 세포 현탁액의 상단 80 %를 전송합니다. glia 도금 매체의 추가 2-3 ML (및 필요한 경우 작은 피펫을 사용하여)과 조직 분쇄를 반복, 다시 조직이 정착하도록하고, 이전 컬렉션 가기 80 %를 추가합니다. 280에서 15 분 동안 glia 도금 매체와 원심 분리기 20 ML로 전체 볼륨을 가지고 g (또는 IEC Centra CL2의 원심 분리기에서 1300 RPM). </li><li> 뜨는을 기음과 glia 도금 매체에있는 세포 펠렛을 (약 사용 새끼의 수에 따라 5-7 ML 사용) resuspend, 다음 해부 각 뇌의 10 ML을 위해 추가적인 도금 매체를 추가합니다. 각 75cm 2 플라스크 (술병 당 즉, 일사불란)에 잘와 플레이트 세포 현탁액의 10 ML을 섞는다. </li><li> 37 보육 집합 문화 flasks를 이동 ° C CO2 (5-10%, 나트륨 bicarbona에 비례매체의 테 컨텐츠). 다음 24-48시간, 모든 3-4일 후 배지를 변경합니다. </li></ol> 2. 보조 Glia (도금 뉴런 전 48시간) <ol><li> 각 세탁 및 autoclaved thermanox의 원주 주위에 녹은 왁스 paraplast 3 작은 방울을 추가하여 thermanox coverslips을 (뉴런이 요리 도금 될 경우) 준비합니다. 세포는 thermanox의 측면에 도금 것입니다. 상용 문화가 잘 삽입을 대신 사용할 수 있지만 우리 thermanox가를 통해 뚫고 ~ 50 2mm 구멍이있는 플라스틱 (시약의 표 VI 참조)에서 잘라 손으로 재사용 ~ 60mm 삽입됩니다. </li><li> 적극적으로 모든 무소속 세포를 제거하는 각각의 플라스크를 흔들어, PBS로 두 번 기본 glia 씻으십시오. 합류 기본 glia 각 플라스크는 약 10,000,000 astroglia를 제공합니다, 그러므로 우리는 정기적으로 실험마다 2-4 flasks을 사용합니다. </li><li> 0.05 % tryspin - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (PBS 9 ML에 희석 한 mL10X 0.5 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 주식 솔루션)와 세포를 분리합니다. CombiNE는 한 50 ML 원뿔 튜브로 2 flasks의 세포 및 (시약의 표 II 참조) glia 도금 매체의 동일한 금액을 추가합니다. 280 G.에서 15 분 동안 원심 분리기 뜨는을 기음과 glia 도금 매체 몇 ML에 glia 펠렛를 해산. </li><li> hematocytometer를 사용하여 세포를 카운트하고 (~ 1x10 6 셀 / ML) 필요에 따라 세포 현탁액을 희석, 플레이트는 (60mm 요리 (뉴런이 coverslips에 도금 될 경우), 또는 thermanox의 coverslips에 두 세포는 뉴런이에 도금 될 경우 60mm 요리). 전지는 접시 또는 glia 도금 매체를 사용하여 thermanox 당 500,000 세포에 도금한다. 다음 이시간 glia 도금 매체에 플립 thermanox 및 잠수함 세포 후 thermanox coverslips, dropwise 방식으로 세포의 판 600 μL의 경우에는. </li><li> 의 연결을 coverslips을위한 보조 glia의 60mm 요리를 준비하는 경우의 연결을 절개하기 전에 저녁 N2.1로 매체를 변경할 수 있습니다. </li></ol> 3. 의 연결을 해부문화 <ol><li> 물리적으로 세포 레이어를 분리하여 세포 스크레이핑을 방지하기 위해, 각 멸균 coverslip의 원주 주위에 녹은 왁스 paraplast 3 작은 방울을 추가하여 유리 coverslips (15mm 직경)을 준비합니다. 세포는 coverslip의 측면에 도금 것입니다. </li><li> 코트 플레이트 또는 0.5 MG / ML polylysine (중 폴리 - L - 라이신 또는 borate 버퍼에 녹아있는 폴리 - D - 라이신, 테이블 VI 참조) coverslips 이시간 또는 밤새하십시오. 멸균 물을 2-3 번 씻고 완전히 건조 수 있습니다. 참고 : coverslips이 coverslips가 조직 문화 요리에 배치하는 경우 쉽게 발생할 수있는 폴리 - 라이신 또는 셀 도금과 함께 코팅 동안 흘리고 / 솔루션의 확산 방지에 소수성 페트리 접시에 배치됩니다. </li><li> glia의 해부 (단계 1.1)에 대한로의 연결을 해부 준비. 17 일 임신 쥐를 안락사, 70 % 에탄올로 모피를 스프레이하고, 자궁을 노출 피부를 통해 medially 했네요. 모든 fetuses를 제​​거하고 그들을 대신멸균 100mm 요리. </li><li> 신속하게 차가운 해부 매체 (4 ML)와 자체 60mm 요리의 각 머리를 배치, 무료 해부하다 각 태아 목을 벨. 약 20,000,000 뉴런은 각 E17 태아에서 파생된로 우리는 일반적으로 실험마다 4-5 fetuses을 해부하다. 더 많은 배아가 필요한 경우, 전체 절차 (단계 3.4-3.12에서)이 90-1백분보다 마지막으로 더 있지 않은지 확인하십시오. </li><li> stereomicroscope 및 No.1/No.5 집게를 사용하면, 피부와 두개골을 열고 당기는 두뇌를 추출, 반구를 분리하고, midbrain과 meninges을 제거하여 대뇌 cortices을 분리. </li><li> 차가운 해부 매체와 신선한 60mm 요리의 모든 해부 cortices를 수집하고 ~ 1mm의 조각으로 굽은 가위로 조직을 말하다. </li><li> 멸균 15 ML 튜브에 다진 조직을 전송합니다. 차가운 해부 매체와 4.5 ML에 볼륨을 준비하고 2.5 %의 트립신 500 μL를 추가합니다. 15 minu에 대한 Parafilm에 튜브를 싸서 36 ° C의 물을 욕조에 플로트역전으로 5 분마다 혼합 tes. </li><li> 이월 트립신 함유 해부 매체의 볼륨을 최소화, 새로운 15 ML 튜브에 조직을 전송합니다. 신선한 해부 매체와 4.8 ML 가져오기 60 ug / ML의 최종 농도에 도달 200 μL DNase를 추가합니다. 멸균 5 또는 2 ML의 피펫과 함께 약 10 번 씹다, (감기) 화재 - 광택 파스퇴르 피펫은 조직의 대부분을 떼어 놓다 위해 사용 필요에 따라이 단계를 반복합니다. 4~5분을 받아들여야 그렇다면 (있는 경우 일반적으로 거의)이 조직의 남은 조각 수 있습니다. </li><li> 조직의 정착 조각 뒤에 떠나는 동안 위 단일 셀 서스펜션을 제거하고 신경 세포 도금 매체의 동일한 볼륨 (표 III 참조) 새로운 튜브에이 솔루션을 넣으십시오. 하지만 부드럽게 잘 혼합 후, 세포를 포함, 15mm coverslips (200 μL에서 35,000 전지 각) 또는 60mm 요리 (1x10 6 셀 3 ML의 각)에 플레이트가 필요. 인큐베이터 (36.5 ° C, 5~10%의 CO2)로 세포를 전송합니다. </li><li> 3-4시간의 COMBIN 후E는 신경 세포의 레이어와 보조 glia은 다음과 같습니다. 60mm 요리에 신경 들어, 따뜻한 DMEM으로 세포를 씻어 혈청 무료 매체의 4mL (N2, 표 IV 참조) 매체를 변경하고 각 플레이트 (glial 세포가 뉴런에 직면한다)에 glia 한 thermanox를 추가합니다. 아래층으로 직면하고있는 뉴런의 연결과 함께 coverslips, 보조 glia의 각 60mm 요리로 전송 3-5 coverslips. </li><li> 24시간 뉴런을 도금 후, glia 확산을 방지하기 위해, 각각의 접시에 사이 토신 - β - D - arabinofuranoside 10 μm의를 추가합니다. 우리는 4 MM 주식 솔루션을 준비 N2 매체와 1시 10분을 희석, 25 UL / 각 접시에 희석 솔루션의 ML을 추가합니다. </li><li> 정확한 시간은 원하는 차별화의 단계에 따라 달라집니다 있지만 셀은 일반적으로, 문화에 70~10일 후 실험에 사용되는, 그들은 생존에 큰 감소없이 사주까지 성장했습니다. 첫번째 주 후에, 그것은 미디어의 절반 볼륨이 매주 교체하는 것이 좋습니다. </li></ol> 뉴런은 기판에 부착된 가지고 몇 시간 후, 그들은 lamelliopodia을 연장 시작합니다. 프로세스가 길어지다 (그림 2A)와 문화에 며칠 동안 분극 계속 및 확장 axons과 dendrites는 (그림 2B, MAP2 얼룩) 명확하게 볼 수 있습니다. 뉴런은 돌기 arbors 더 정교한되고 성숙하고 그들은 시냅스 연락처를 개발로서, 약 2~3주 많은 돌기 쪽이을 도금 후 표시 (그림 2C) 11입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3257/3257fig1.jpg" /> 그림 1. glial 피더 층 (보조 glia)와 함께 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 절차의 플로우 차트. 먼저, 11 일의 연결을 절개하기 전에 기본 glia 문화 신생아 쥐 (P2 - 4)에서 준비가되어 있습니다. 세포가 합류하는 경우 (약 구일의 연결을 절개하기 전에 기본 glia 두 일 도금 후), astrocytes가 mech입니다anically 요리 또는 thermanox에 oligodendrocyte 전구체 세포 microglia 및 도금하거나 (보조 glia)에서 분리. 뉴런은 다음 E17 배아와 coverslips 또는 요리 (폴리 - 라이신과 코팅)에 중 도금의 cortices에서 얻을 수 있습니다. 도금 후 네 시간은,의 연결 계층은 2 차 glia에 추가됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3257/3257fig2.jpg" /> 그림 2 여러 단계에서 문화의 예 (예 : 5시간, 12 DIV, 21 DIV).. 수치는 다른 시간 시점에서 coverslips에서 대뇌 피질의 뉴런의 대표적인 이미지입니다. 뉴런가 첨부 후 기판 뉴런은 lamelliopodia을 연장 시작합니다. 위상 콘트라스트 이미지가 5 시간 도금 후 몇 가지 확장 neurites를 (A)를 보여줍니다. 중간에 이미지 (B, 쿡 외. 2010, 허가)는 고정하고의 연결 돌기 마커 MAP2와 immunostained 12 DIV 대뇌 피질의 뉴런을 보여줍니다. Hoechst의 얼룩은 counterstai로 사용되었다닝. 뉴런이 돌기의 쪽이을 성숙으로 또한 (C) 표시됩니다. 스케일 바 : A, B = 25 μm의, C = 10 μm의.

<ol>
	<li>Cook, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+chemokines:+regulation+of+fractalkine/CX3CL1+homeostasis+by+SDF/CXCL12+in+cortical+neurons.">Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons.</a> J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).</li><li>Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12+inhibits+expression+of+the+NMDA+receptor's+NR2B+subunit+through+a+histone+deacetylase-dependent+pathway+contributing+to+neuronal+survival.">CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor's NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival.</a> Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).</li><li>Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+increases+brain+levels+of+ferritin+heavy+chain+leading+to+inhibition+of+CXCR4-mediated+survival+signaling+in+neurons.">Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons.</a> J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).</li><li>Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+regulate+hippocampal+neuronal+signaling+and+gp120+neurotoxicity.">Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).</li><li>Khan, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+P53+activity+by+CXCR+4.">Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4.</a> Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).</li><li>Patel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neuronal+CXCR4+by+the+micro-opioid+agonist+DAMGO.">Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO.</a> J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).</li><li>Shimizu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transcription+factor+E2F1+in+CXCR4-mediated+neurotoxicity+and+HIV+neuropathology.">Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology.</a> Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).</li><li>Khan, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+CXCR4+regulates+cell-cycle+proteins+in+neurons.">The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons.</a> J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).</li><li>Khan, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+CXCL12+promotes+survival+of+postmitotic+neurons+by+regulating+Rb+protein.">The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein.</a> Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).</li><li>Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12-mediated+regulation+of+ANP32A/Lanp,+a+component+of+the+inhibitor+of+histone+acetyl+transferase+(INHAT)+complex,+in+cortical+neurons.">CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons.</a> J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>D'Ambrosio, J., Fatatis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+modulate+Ca2++signaling+in+bone-metastatic+prostate+and+breast+cancer+cells.">Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

뉴런 쉽게 실험 분석을 위해 격리 수 있도록하면서이 프로토콜은, glia 세포의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 기본 방법을 제공합니다. 건강의 연결 표현형의 glia 지원 개발하는 동안 생리학 관련성이 높은 방식으로 실험 트리 트먼트도 modulating의 연결 반응. 또한, 따라서 염증 microglial 자극을 방지하는이 세포 인구가 선택 astrocytes에 농축되는 뉴런과 culturing하기 전에 기본 glia를 passagin...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>16 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>135 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>0.22 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmolarity</td>
			<td>310&plusmn;10 mOsm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Dissection Medium.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>50 &mu;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabe 2. Glia Plating Medium.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Neuron Plating Medium.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>50 mg/100mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 4. N2 Medium.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borate</td>
			<td>12.5 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Company</th>
			<th>
				Catalogue number</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco's Modified Eagle 
			Medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>26400-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, Heat-inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>H1138</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750-060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from chicken egg white, Grade VI 
			(Ovalbumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15400-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas 
			(DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-646-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine-&beta;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica ZOOM 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 
			0.13-0.17 mm</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>633031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox sheets</td>
			<td>Grace BioLabs</td>
			<td>HS4550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large forceps</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>70-4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped No.5 forceps</td>
			<td>Fine Science 
			Tools</td>
			<td>91150-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern No.1 forceps</td>
			<td>Biomedical 
			Research</td>
			<td>10-1400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, sharp-blunt</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>28-1435</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting scissors</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>11-2070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved scissors</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>11-1395</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia

이 비디오는 glial 피더 층, bilaminar 또는 공동 문화 모델로 알려진 시스템의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런의 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 이 시스템은 유리 또는 플라스틱의 성장 기판 중 하나를 필요로하는 실험이 필요 다양한하기에 적합하며 뉴런의 다른 유형의 문화도 사용할 수 있습니다. 후반 배아 단계 (E17)에서 얻은 쥐 대뇌 피질의 뉴런은 유리 coverslips 또는 각각 접시 또는 플라스틱 coverslips (Thermanox라고도 함)에 대한 성장 glia의 피더 레이어를 마주 조직 문화 요리에 도금입니다. 두 구성 사이의 선택은 특정 실험 요구할 수 사용 기법, 또는하지에 따라, 그 뉴런이 유리 (예 : 칼슘 이미징 비해 서양 얼룩)에 성장하고 있습니다. glial 피더 레이어 혼합 glia의 astroglia - 풍부한 차 문화, 별도의 연결을하기 전에 신생아 쥐 새끼의 cortices (P2 - 4)에서 준비가되어 있습니다해부. 뉴런의 문화에 비해이 문화 시스템의 가장 큰 장점은의 연결을 성장, 생존, 그리고보다 정확하게 생체내의 뇌는 환경과 유사한 glial 피더 계층에서 분비 영양 요소에서 제공하는 분화의 지원입니다. 또한, 공동 문화의 연결 - glial 상호 작용 1 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 동시에,의 연결 레이어에 glia 오염은 다른 설립 방법 1 비교 사실상 순수의 연결 레이어에 이르는 다른 수단 (저밀도 문화, mitotic 억제제의 추가, 최적화된 배지의 혈청 및 사용의 부족)에 의해 차단됩니다 -3. 뉴런은 쉽게 문화 중에 언제든지 glial 계층에서 분리하고 전기 생리학 4 세포와 분자 생물학 5-8, 생화학 5, 이미징 및 마이크에 이르기까지 다양한 실험적인 애플 리케이션에 사용될 수 있습니다roscopy 4,6,7,9,10. 기본 뉴런 일부 세포 라인 프로세스를 확장 할하지만, 기능 시냅스의 연결에게 셀 라인에서 관찰되지 않는 프로세스를 11 형태 axons과 dendrites을 연장. 이 공동 문화 시스템을 사용 culturing 쥐 hippocampal 뉴런의 상세한 프로토콜은 이전에 설명한 4,12,13되었습니다. 여기 세부 대뇌 피질 뉴런에 적합 수정된 프로토콜을. 약 20x10 6 셀 각 쥐의 배아에서 발견한 있으므로,이 방법은 뉴런 (그러나 매우 동질적인 인구의 연결에 대해 우려하지 않음) 많은 숫자가 필요한 실험에 특히 유용합니다. 뉴런과 glia의 준비 시간을 특정 방식으로 계획해야합니다. 우리는 뉴런을 지원하기 위해 단계별 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜뿐만 아니라 culturing glial 세포를 제공할 것입니다.

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Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.5K 조회수.  Drexel University College of Medicine. 여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

비디오: Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.