이 프로토콜은 생체 내 연구 전에 백신 면역원성을 측정하기 위해 소 단핵구 유래 수지상 세포를 사용하는 기능적 시험관 내 분석을 나타냅니다. 따라서 가축 백신학의 기존 격차를 메우고 있습니다. 수지상 세포의 생성과 응용입니다.
가장 강력한 항원 제시 세포인 수지상 세포는 백신 효능을 포함한 세포 내 면역 메커니즘을 이해하기 위한 핵심 연구 대상이 되었습니다. 이 분석은 백신 후보 스크리닝, 백신 생산을 위한 품질 관리 상태, 항원 및 보조제 선택을 위한 도구로 구현될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 동물 생산 및 건강 실험실의 과학자 인 Richard Kangethe가 될 것입니다.
송아지의 경정맥 천자에서 얻은 혈액을 헤파린 처리 된 진공 테이너와 혼합하여 시작하십시오. 그런 다음 20 밀리리터의 헤파린 화 된 혈액을 멸균 된 50 밀리리터 튜브에 옮기고 10 밀리리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 희석하십시오. 15 밀리리터의 림프구 분리 배지를 멸균된 50 밀리리터 튜브에 피펫팅하고, 튜브를 45도 위치로 기울인다.
25밀리리터 피펫을 사용하여 림프구 분리 위에 30밀리리터의 혈액 PBS 배지를 조심스럽게 겹치고 튜브를 원심분리하기 전에 천천히 수직 위치로 되돌립니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC 층의 얇은 흰색 층을 수집하고 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세척 당 40 밀리리터의 PBS를 사용하여 수확 된 PBMC를 두 번 세척하고 완전히 혼합합니다.
원심분리 후, 펠릿을 15 밀리리터의 염화 암모늄 칼륨 완충액 또는 ACK 완충액에 재현탁시킨다. 실온에서 10 내지 15 분 동안 배양 한 후, 최대 40 밀리리터의 PBS를 첨가하고 최대 가속 및 감속으로 튜브를 원심 분리한다. 펠릿을 10 밀리리터의 완전한 배양 배지에 재현탁시킨다.
그런 다음 세포 1,000만 개당 5마이크로리터의 CD14 MicroBead 버퍼를 추가하고 피펫을 사용하여 완전히 혼합합니다. 유세포 분석을 위해 10마이크로리터의 CD14 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC 염색 항체를 PBMC에 추가하고 유세포 분석을 진행하기 전에 섭씨 4도에서 8도에서 15분 동안 배양합니다. 염색되지 않은 PBMC에 1밀리리터의 팩스 버퍼를 추가하고 500g 및 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리합니다.
그런 다음 펠릿을 1억 개의 세포당 500마이크로리터의 팩스 버퍼에 재현탁합니다. 다음으로, 면역자기 세포 분리 컬럼을 분리기에 삽입하고 플로우 스루를 수집하기 위한 컬럼 출구 아래에 50 밀리리터 수집 튜브를 배치합니다. 1밀리리터의 탈기된 팩스 버퍼로 컬럼을 세척한 후 사용한 15밀리리터 튜브를 새 것으로 교체합니다.
한 번에 500 마이크로리터의 완충액에 1억 개의 세포를 피펫팅하여 세포 현탁액이 컬럼을 통과할 수 있도록 합니다. 그런 다음 매번 3밀리리터의 탈기된 팩스 버퍼로 컬럼을 세 번 헹굽니다. 플로우 스루를 수집한 후 첫 번째 용출된 나이브 림프구 분획을 CD14 음성 세포 분획으로 표시합니다.
분리기에서 컬럼을 제거하고 폐수 수집을 위해 컬럼 아래에 새 멸균 15밀리리터 튜브를 놓습니다. 팩스 버퍼 5밀리리터를 컬럼에 넣고 플런저를 사용하여 즉시 밀어 넣습니다. 두 번째 통과 또는 나이브 단핵구 분획을 수집하고 CD14 양성 세포 분획으로 표시합니다.
수확된 CD14 양성 단핵구에 완전한 배양 배지를 추가하여 밀리리터당 100만 개의 세포를 얻습니다. 다음으로, 키트에 제공된 40 마이크로리터의 사이토카인 칵테일로 각 웰을 보충하기 전에 멸균된 24-웰 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 세포 현탁액을 첨가한다. 둘째 날에는 피펫을 사용하여 각 웰 내용물의 절반을 개별 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
1.5 밀리리터 튜브를 500g에서 7분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고 펠렛을 500 마이크로리터의 신선한 완전 배양 배지에 재현탁시킨다. 이 재현탁된 세포 현탁액 500 마이크로리터를 상응하는 웰로 다시 이송하여 웰 내의 최종 부피가 1밀리리터가 되도록 한다. 20 마이크로 리터의 사이토 카인 칵테일로 각 웰을 풍부하게하십시오.
항원 펄스 MoDC를 생성하려면 24웰 플레이트에서 1밀리리터의 나이브 MoDC 배양에 1밀리리터당 1마이크로리터의 광견병 바이러스 백신 또는 RV 현탁액을 추가하고 플레이트를 5% 이산화탄소 및 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. 7일째에 항원 펄스 MoDC가 들어 있는 24웰 플레이트를 10분 동안 얼음 위에 보관한 후 웰당 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하고 완전히 혼합합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 우물을 씻으십시오. 각 웰 내의 잔류 세포를 수집하고 세척된 내용물을 각각의 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 500g에서 7분 동안 원심분리한다.
상청액을 버린 후, 항원 펄스 MoDCs 세포 펠릿을 완전한 배양 배지에 재현탁하여 최종 농도를 밀리리터 당 100, 000 세포로 조정한다. MoDC-림프구 공동 배양의 경우, 항원 펄스의 7일째에 1밀리리터의 나이브 림프구 세포 현탁액과 1밀리리터의 항원 펄스 또는 비항원 펄스 MoDC 현탁액으로 멸균된 24웰 플레이트의 웰을 시딩합니다. 2 일간의 배양 후, 각 웰에 밀리리터 당 20 나노 그램의 재조합 인터루킨 -2를 보충하고 120 시간 동안 배양을 계속한다.
14일째에, 공배양물 1밀리리터를 멸균된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고, 튜브를 원심분리한다. 그런 다음 1밀리리터의 항원 펄스 또는 비펄스 MoDC로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 잘 섞고 세포 현탁액을 해당 웰로 옮깁니다.
PBMCs 및 나이브 림프구 및 단핵구의 세포 표면 염색 후, 500g에서 10분 동안 피펫 및 원심분리기를 사용하여 1 밀리리터의 세포 현탁액을 멸균된 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 그런 다음 펠릿을 1 밀리리터의 PBS에 재현 탁하고 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 또한 1 밀리리터의 PBS를 사용하여 잔류 세포와 해당 튜브를 수집합니다.
그런 다음 세포가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 PBS를 넣고 피펫 팅으로 혼합합니다. 튜브를 850g에서 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 상층액을 디캔팅한 후 남은 잔류 현탁액으로 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 세포 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트로 옮기고 유출을 방지하기 위해 웰을 밀봉합니다.
염색이 완료되면 유세포 분석기 분석을 수행합니다. 실시간 미리보기에서 전압, 게인 및 세포 크기를 포함한 형광 임계값을 조정하여 최종적으로 세포 파편을 배제하면서 원하는 세포 집단 주위에 게이트를 그립니다. CD14 세포 염색 및 유세포 분석은 나이브 단핵구 분획이 98% CD14 양성 단핵구 세포로 구성되고 기능적으로 항원 흡수가 가능하다는 것을 보여주었습니다.
MHC 클래스 2 및 공동 자극 CD86 및 CD40 세포 표면 마커의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는 나이브 MoDC는 수지상 세포 또는 DC 유사 표현형을 검증했습니다. 9일째 MoDC 림프구 공동 배양 동안, 수상돌기 확장을 나타내는 형태학적 변화가 MoDC에 대한 RV 펄스에서 관찰되었습니다. 비펄스 MoDC 림프구 배양과 비교하여, 펄스 MoDC 림프구 공동 배양에서 16일째에 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포에 대한 Ki67 및 CD25 활성화 마커의 상향 조절에 의해 림프구 증식의 상당한 증가가 입증되었습니다.
성숙한 RV 펄스 MoDC 공동 배양의 CD8 양성 T 세포는 비특이적 그룹에 비해 Ki67의 8배 상향 조절을 나타냈습니다. 동일한 공동 배양에서 CD4 양성 세포는 대조군에 비해 Ki67이 7배 증가한 것으로 나타났으며, 이는 RV 프라이밍 MoDC가 RV 항원을 나이브 림프구에 제시하고 시험관 내 조건에서 활성화하는 능력을 입증했습니다. 공동 배양의 qPCR 정량화는 GAPDH를 교정기로 사용한 모든 공동 배양에서 인터페론 감마 발현의 30% 이상 증가와 Ki67 발현의 5% 이상의 증가를 보여주었습니다.
비특이적 처리군에 비해 RV 펄싱된 MoDC 림프구 공동 배양에서 유의하게 더 높은 농도의 분비된 인터페론 감마가 관찰되었습니다. 레이어링 단계를 매우 천천히 그리고 조심스럽게 수행하여 혈액이 림프구 분리 배지 위에 놓이도록 합니다. 다른 레이어에서 너무 많은 재료를 수집하지 않고 모든 PBMC를 수집하도록 각별히 주의하십시오.
유세포 분석, ELISA 및 정량적 PCR과 같은 다른 방법은이 절차 후에 적용하여 면역 마커의 활성화를 평가할 수 있습니다.
