당사의 프로토콜은 다양한 세포주에서 복제 스트레스의 마커인 단일 가닥 DNA를 정량화하는 매우 효율적이고 쉽게 재현 가능한 방법을 제시합니다. 또한 단순성으로 인해 처리량이 많은 응용 프로그램과 화면이 가능합니다. 특히, 이 방법은 여러 난소암의 특징인 복제 스트레스의 신속한 정량화를 가능하게 합니다.
또한 호스트 자동 분석 소프트웨어를 사용할 수 있어 효율성을 더욱 높일 수 있습니다. 단일 가닥 DNA는 현재 DNA 복구 경로를 표적으로 하는 화학 요법에 대한 반응을 위한 바이오마커로 활발히 고려되고 있습니다. 따라서 이 방법은 해당 시나리오에 매우 적합합니다.
복제 스트레스는 난소암 맥락 또는 BRCA1, BRCA2 결핍 암을 넘어 존재합니다. 따라서, 이 방법은 다양한 다른 세포 유형 또는 질병 맥락에 적용될 수 있다. 시작하려면 오토클레이브 12mm 직경의 커버 슬립과 폴리라이신 용액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 추가하여 폴리라이신 코팅 커버 슬립을 만들고 로커에 15분 동안 놓습니다.
조직 배양 후드에서 용액을 흡인합니다. 멸균수를 추가하여 커버 슬립을 세척하고 커버 슬립이 들어 있는 튜브를 로커에 5분 동안 다시 놓습니다. 커버 슬립을 세 번 씻은 후 튜브에서 물을 흡입하고 커버 슬립을 멸균 접시에 펼칩니다.
남은 물을 흡인하고 조직 배양 후드에서 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 Parafilm으로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에 놓습니다. 사전 추출 단계 동안 커버 슬립으로부터 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해, 하나의 폴리리신 코팅된 커버 슬립을 24-웰 플레이트의 각 웰에 배치한다.
OVCAR3 세포가 70 내지 80% 밀도에 도달하면, 플레이트로부터 배지를 흡인하고, 세포를 5 내지 7 밀리리터의 PBS로 세척한다. 플레이트에서 PBS를 흡인합니다. PBS를 흡인 한 후 1 밀리리터의 0.25 % 트립신을 넣고 섭씨 37 도의 인큐베이터에 8-10 분 동안 또는 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려 질 때까지 접시를 놓습니다.
5 내지 10 밀리리터의 배지로 세포를 모으고 세포 현탁액을 원추형 튜브에 첨가한다. 표준 절차를 사용하여 혈구계로 수동으로 세포를 계산합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 희석하고, 3 개의 집단 후에 70-80 %의 confluency를 산출 할 수있는 수를 얻는다.
24-웰 플레이트의 웰에 놓인 폴리라이신 커버 슬립에 1 밀리리터의 세포 현탁액을 첨가하고, 표준 조건 하에서 배양 배지에서 세포를 성장시킨다. 한 집단 배가 후, 플레이트에서 기존 배지를 흡인하고 두 개의 후속 집단 배가를 위해 10 마이크로몰 IdU로 세포를 펄스합니다. 세포를 채취하기 위해, 배지를 얼음 위에서 5분 동안 얼음 위의 얼음 차가운 0.5% PBSTx로 교체한다.
세포 고정을 위해 PBSTx를 흡인하고 실온에서 3% 파라포름알데히드로 15분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 3-4회 세척한 후 추가 사용이 있을 때까지 고정 셀을 섭씨 4도로 유지하십시오. 고정 후 얼음 위에서 0.5% PBSTx를 사용하여 5분 동안 세포를 투과시켜 전체 커버 슬립을 덮도록 합니다.
세포를 실온에서 0.2% PBST 1밀리리터로 3 내지 4회 세척한 후, PBST를 흡인하고 PBS로 만든 5%BSA를 사용하여 시료를 실온에서 30분 동안 차단하였다. 면역 염색을 위해 평평한 바닥 Tupperware에 젖은 종이 타월을 올려 통합 챔버를 준비하십시오. 24웰 플레이트 뚜껑을 Parafilm으로 덮습니다.
가습실에 넣고 플레이트 뚜껑에 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립 상단에 희석된 항-BrdU 1차 마우스 항체 60마이크로리터를 추가합니다. 또는 항체가 건조되는 것을 줄이고 부피를 줄이려면 희석된 항체 한 방울을 파라필름에 떨어뜨리고 커버 슬립을 뒤집습니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 1차 항체를 흡인한다. 커버를 다시 24-웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척한다.
앞서 설명한 대로 커버 슬립에 희석된 2차 항체를 추가하고 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 DAPI 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 장착 매체를 경화 또는 경화해야 하는 경우 슬라이드를 실온의 어두운 곳에 24시간 동안 보관하십시오.
0.5 밀리몰 하이드록시우레아로 처리되지 않고 처리된 세포에서 유래된 핵을 염색하고 DAPI 및 IdU 채널에서 식별할 수 있었습니다. 이 이미지의 분석은 각 핵의 초점 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. 초점의 수는 복제 스트레스의 정도에 비례합니다.
IdU 펄스 시간은 더 길거나 더 짧은 배가 기간 동안 변할 수 있으므로 선택한 세포주의 배가 시간을 고려하는 것이 중요합니다. 또는 복제 단백질 A에 대해 세포를 조사하여 결과를 확인하고 세포의 다양한 복제 스트레스 반응을 평가할 수 있습니다. 이 기술은 단일 변형된 DNA의 축적을 검사하기 위해 DNA 손상 유도제와 함께 많은 세포주에 사용됩니다.
따라서 이 방법은 널리 접근 가능하고 적용 가능합니다.
