인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 염색된 면역 형광에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 된 포시를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다. 면역 형광 화상 진찰은 민감한 방법이며 이온화 방사선과 같은 DNA 손상 에이전트에 대한 응답으로 foci에서 수리 경로 단백질의 출현에 대한 시각적 증거를 제공합니다. 중성자 혼합 빔은 붕소 중성자 포획 요법, BNCT 및 방사선 유발 DNA 손상 반응이 완전히 확립되지 않은 데 사용된다.

우리의 프로토콜은 또한 다른 높은 LET 빔에 의한 방사선으로 인한 세포 수준에서 생물학적 효과의 분석에 유용 할 수있다, 양성자 빔 치료를 사용하여 양성자 빔 또는 하드론 치료를 사용하여 탄소 이온과 같은. 조사 후, 부착 된 세포에서 배지를 제거하고 PBS의 2.5 밀리리터로 한 번 세척하십시오. 그런 다음 10 분 동안 70 %의 에탄올의 1 밀리리터로 세포를 수정합니다.

세포를 투약화하려면 에탄올을 제거하고 PBS의 2.5 밀리리터로 세척하십시오. PBS에 2%트리톤 X-100의 밀리리터 1밀리리터를 부드럽게 추가하여 커버립을 덮고 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 세포를 세 번 세척하고 PBS에서 희석된 2%BSA의 1밀리리터로 투과화를 차단합니다.

그런 다음 2%BSA로 최소 30분 동안 세포를 배양한다. 세포를 염색하려면 텍스트 원고에서 권장되는 대로 PBS에서 희석된 1차 항체의 적절한 양을 BSA로 추가합니다. 그런 다음 페트리 접시를 덮고 습도를 유지하기 위해 보습 리그닌이있는 플라스틱 상자에 놓습니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션을 사용하세요. 인큐베이션 후 PBS로 3개의 세차스를 수행하고 적절한 양의 이차 항체를 첨가한다. 수분이 있는 리그닌으로 접시를 플라스틱 상자에 반납하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS로 세초를 반복하고, 핵을 카운터스테인하기 위해 밀리리터 당 1 마이크로그램의 최종 농도로 희석된 DAPI의 100 마이크로리터를 추가한다. 실온에서 최대 2분 동안 세포를 배양하고 PBS로 세척을 반복합니다. 마지막 세척 후 PBS를 제거하고 장착 매체 위에 커버슬립을 부드럽게 놓아 기포의 형성을 피하십시오.

매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경 검사를 수행하기 전에 장착 매체가 굳어지게 합니다. DNA 이중 좌초 휴식의 표준 마커인 감마-H2AX 포치는 중성자 혼합, 빔 조사 및 비조사 대장 암세포에서 검출되었다. foci는 뚜렷한 형광점으로 나타납니다.

감마-H2AX 포시의 높은 직경은 조사된 세포에서 관찰되었다. 더욱이, 핵을 가로지르는 고-LET 알파 입자의 단일 트랙이 검출되었다. 면역형광 현미경 검사는 대표적인 수리 단백질 Rad52 및 DNA 의존성 단백질 키나아제검출을 위해 사용되었다.

DNA 의존성 단백질 키나아제 포시 직경의 높은 평균 값은 대조군 세포와 비교하여 조사 후 DNA 휴식시 측정하였다. 클러스터된 DNA 이중 좌초 휴식은 조사된 세포에서 더 복잡하고, 더 크고, 더 높은 강도로 클러스터된 초점으로 관찰되었다. 면역 형광 염색의 가장 중요한 단계는 세포의 고정 및 세포막의 투과화입니다.

이 단계는 항체가 그 세포 및 세포내 복구 단백질로 쉽게 침투하는 것을 허용하기 위하여 요구됩니다. 이 절차는 셀룰러 수준에서 각 수리 경로의 활성화에 대한 정보를 제공합니다. 결과는 실시간 PCR과 같은 분석서를 사용하여 분자 수준에서 확인되어야 합니다.

이 기술은 연구원이 항암 치료를 사용하여 다른 광선의 경우에 완전히 결정되지 않은 방사선 유도한 DNA 손상 반응을 탐구하는 가능하게 합니다.